CRISPR/Cas9基因敲除细胞株详细构建流程

Puro 抗性浓度摸索实验

将细胞如下图1稀释。给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。

图1 抗性浓度摸索

单克隆形成验证实验

细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。

sgRNA 靶标设计

根据基因序列信息，设计 sgRNA。

靶标位点序列信息确认

PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。

图2 靶标序列扩增

sgRNA克隆引物合成

根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。

lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建

退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。

lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证

每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。

图3 质粒抽提

酶切验证 ：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。选择2个样品送样测序。

图4 单克隆酶切验证

病毒包装

lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。

细胞转染

配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。

阳性单克隆细胞株筛选

细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。

阳性单克隆细胞株验证

测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。

实验结果示例：

该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。

单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。

单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。