实验诊断-临床血液学检测：骨髓细胞学检测

骨髓细胞学检测

骨髓细胞学检测

一、骨髓细胞学检测的临床应用

1.骨髓细胞学检测的临床应用

（1）诊断造血系统疾病：各种类型白血病、多发性骨髓瘤、巨幼细胞贫血、戈谢病、尼曼-匹克病等。

（2）辅助诊断某些疾病：恶性肿瘤的骨髓转移、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤等。

（3）提高某些疾病的诊断率：  疟原虫、黑热病原虫、红斑狼疮细胞等。

2.检查的适应证与禁忌证

（1）适应证：外周血细胞成分及形态异常；不明原因发热，肝、脾、淋巴结肿大；骨痛等

（2）禁忌证：出血性疾病、晚期妊娠的孕妇

二、骨髓细胞学检测的方法和内容

1.肉眼观察

染色正常、厚薄适当、尽可能有骨髓小粒的涂片

2.低倍镜下检查

（1）骨髓的取材、涂片、染色效果、细胞分布是否均匀

（2）估计骨髓有核细胞增生程度

（3）计数巨核细胞数目

（4）特殊细胞与其他：戈谢细胞、Niemann-Pick细胞等

（5）血液寄生虫

骨髓有核细胞增生程度分级

增生程度	成熟红细胞∶有核细胞	有核细胞均数/高倍镜视野	常见病例
增生极度活跃	1∶1	>100	急慢性白血病
增生明显活跃	10∶1	50～100	急慢性白血病、增生性贫血
增生活跃	20∶1	20～50	正常骨髓象、增生性贫血
增生减低	50∶1	5～10	再生障碍性贫血
增生极度减低	200∶1	＜5	再生障碍性贫血

3.油浸镜检查

（1）选择染色良好、细胞分布均匀、形态展示清楚的髓膜体尾交界处观察200～500个细胞，并计算各类细胞的百分率

（2）仔细观察各系统的增生程度和各阶段细胞数量和质量的变化

4.骨髓象的分析与报告

（1）骨髓有核细胞增生程度、粒细胞与有核红细胞比例、各系细胞改变。

（2）巨核细胞单独计数并描述血小板分布状态。

三、血细胞发育过程中形态演变的一般规律

1.细胞体积

（1）胞体由大变小

（2）但巨核细胞体积通常由小变大，早幼粒细胞较原始粒细胞稍大

2.细胞质

（1）量：由少逐渐增多，但淋巴细胞变化不大。

（2）染色：由深蓝变浅染，甚至淡红，红细胞系最终变为橙红色。

（3）颗粒：从无颗粒→嗜天青颗粒→特异性颗粒；单核细胞类似。但幼红细胞胞质内无颗粒。

3.细胞核 

（1）大小：由大变小，由规则变为不规则，甚至分叶，但巨核细胞核由小变大。

（2）染色质：由细致疏松逐渐变为粗糙、致密或凝集成块，着色由浅变深。

（3）核仁：由有到无，经清晰、模糊不清至消失。

（4）核膜：由不明显变为明显。

4.细胞核/细胞质比例

由大变小；巨核细胞则相反。

四、血细胞的正常形态学特征

1.粒细胞系统

各阶段粒细胞形态特点

	原始粒细胞	早幼粒细胞	中幼粒细胞	晚幼粒细胞	杆状核粒细胞	分叶核粒细胞
胞体大小	11～18μm	12～22μm	10～18μm	10～16μm	10～15μm	10～15μm
胞体形态	圆形或类圆形	圆形或椭圆形	圆形	圆形	圆形	圆形
核形	圆形或类圆形	圆形或椭圆形，常偏一侧	椭圆形、一侧扁平或略凹陷	明显凹陷呈肾形、半月形等	呈带状、条状、枝杆状	分叶（2～5叶）
核仁	2～5个	常清楚	常无	无	无	无
染色质	细颗粒	开始聚集	聚集呈索块状	小块状	粗糙呈块状	粗块状
胞质量	较少	较多或多	多	多	多	多
颜色	蓝色或深蓝色	蓝色或深蓝色	蓝色或淡蓝色	淡蓝色	淡蓝色	淡蓝色
颗粒	无或有少许细颗粒	颗粒较多	出现中性颗粒	充满中性颗粒	充满中性颗粒	充满中性颗粒

粒细胞胞质中四种颗粒的鉴别

	非特异性颗粒	中性颗粒	嗜酸性颗粒	嗜碱性颗粒
大小	较中性颗粒粗大 大小不一	细小 大小一致	粗大 大小一致	最粗大 大小不一
形态	形态不一	细颗粒状	圆形	形态不一
颜色	紫红色	淡红或淡紫红色	橘红色	深紫红或深紫黑色
数量	少量或中等量	多	多	不一定、常不多
分布	分布不一、有时覆盖核上	均匀	均匀	分布不一、常覆盖在核上

2.红细胞系统

各阶段红细胞形态特点

	原始红细胞	早幼红细胞	中幼红细胞	晚红粒细胞
胞体大小	15～22μm	11～20μm	8～18μm	7～12μm
胞体形态	圆形或椭圆形，常有瘤状突起	圆形或椭圆形，可有瘤状突起	圆形	常为圆形
核形	圆形，常居中	圆形，常居中	圆形，常居中	圆形，居中或偏位
核仁	1～3个	模糊或无	无	无
染色质	颗粒状	粗颗粒状或小块	块状如车轮状，副染色质明显	固缩成团块状，副染色质可见或无
胞质量	较多	略增多	多	多
颜色	深蓝色、不透明，可有核周淡染区	深蓝色、不透明，可有核周淡染区	灰蓝、灰红色	浅红色或灰红色
颗粒	无	无	无	无

3.淋巴细胞系统

各阶段淋巴细胞形态特点

	原始淋巴细胞	幼稚淋巴细胞	大淋巴细胞	小淋巴细胞
胞体大小	10～18μm	10～16μm	13～18μm	6～10μm
胞体形态	圆形或椭圆形	圆形或椭圆形	圆形或椭圆形	圆形或椭圆形
核形	圆形或椭圆形	圆形或椭圆形	椭圆形，常偏位	圆形、椭圆形或有小切迹
核仁	1～2个	模糊或无	无	无
染色质	颗粒状	较粗	紧密而均匀	块状，副染色质不明显
胞质量	少	少	较多	少或极少
颜色	蓝色	蓝色	清澈的淡蓝色	淡蓝色或深蓝色
颗粒	一般无	偶有少许紫红色颗粒	常有紫红色颗粒	常无颗粒

4.浆细胞系统

各阶段浆细胞形态特点

	原始浆细胞	幼稚浆细胞	浆细胞
胞体大小	12～20μm	12～16μm	8～20μm
胞体形态	圆形或椭圆形	常椭圆形	常椭圆形
核形	圆形，核偏位	圆形，核偏位	圆形，核偏位
核仁	2～5个	模糊或无	无
染色质	粗颗粒状	较粗	块状，副染色质较明显
胞质量	多	多	丰富
颜色	深蓝色，核旁淡染区	深蓝色，核旁淡染区	常深蓝色，有时呈红色
颗粒	无	偶有少许紫红色颗粒	偶有少许紫红色颗粒
空泡	可有	可有	明显

5.单核细胞系统

各阶段单核细胞形态特点

	原始单核细胞	幼稚单核细胞	单核细胞	巨噬细胞
胞体大小	14～25μm	15～25μm	12～20μm	15～20μm
胞体形态	圆形或不规则，有时有伪足	圆形或不规则，有时有伪足	圆形或不规则，有时伪足	圆形或不规则，变异较大
核形	圆形或不规则，可折叠、扭曲	常不规则，呈扭曲、折叠状	不规则，常呈扭曲、折叠状或肾形、马蹄形等	圆形、椭圆形、肾形或不规则形，偏位
核仁	常1个，大而清楚	有或无	无	有或无
染色质	纤细、疏松，呈细丝网状	开始聚集，呈丝网状	呈条索状、小块状	粗或疏松、淡染
胞质量	较多	较多	多	丰富
颜色	蓝色或灰蓝色	蓝色或灰蓝色	灰蓝色或略带红色	不透明灰蓝色或蓝色
颗粒	无或有少许细小颗粒	可见细小、粉尘样淡紫红色颗粒	可有细小、粉尘样颗粒	无或有少量颗粒

6.巨核细胞系统

各阶段巨核细胞形态特点

	原始巨核细胞	幼稚巨核细胞	颗粒型巨核细胞	产血小板型巨核细胞	裸核型巨核细胞
胞体大小	15～30μm	30～50μm	40～70μm	40～70μm	/
胞体形态	圆形或不规则形，常有指状突起	不规则形	不规则形	不规则形，胞膜不完整	/
核形	圆形、椭圆形或不规则形，1～2个核	不规则形	不规则形或分叶后重叠	不规则形或高度分叶但常层叠	不规则形或高度分叶但常层叠
核仁	2～3个，不清晰	常无	无	无	无
染色质	较细，排列紧密且分布不均匀	粗或小块状	呈粗块状或条状	呈块状或条状	呈块状或条状
胞质量	少	较丰富	极丰富	极丰富	无或有少许
颜色	深蓝色或蓝色	深蓝色或蓝色	淡蓝色	淡蓝色	/
颗粒	无	近核处少量嗜天青颗粒	充满大量细小紫红色颗粒	颗粒丰富，外侧有释放的血小板	/
其他	胞体周围常有血小板附着	胞体周围可有血小板附着

7.其他细胞

骨髓中还可以见到网状细胞、内皮细胞、纤维细胞、组织嗜碱细胞、组织嗜酸细胞、破骨细胞及一些退化细胞，如Ferrata细胞（退化的未成熟中性粒细胞）。

五、血细胞的细胞化学染色

（一）髓过氧化物酶染色

1.原理 

血细胞中的髓过氧化物酶（MPO）催化试剂中的联苯胺脱氢氧化并使其化学结构发生变化，与试剂中亚硝基铁氰化钠结合形成稳定的蓝黑色的颗粒，沉着于细胞质中。

2.结果

（1）胞质中无蓝黑色颗粒者为阴性反应

（2）细小颗粒、分布稀疏者为弱阳性反应

（3）颗粒大而密集者根据程度定为阳性、强阳性反应

3.临床意义

（1）主要用于急性白血病类型的鉴别

（2）急性粒细胞白血病时，白血病细胞多呈阳性、强阳性反应

（3）急性单核细胞白血病时，白血病细胞呈弱阳性或阴性反应

（4）急性粒、单细胞白血病会出现阳性和弱阳性、阴性细胞并存的现象

（5）急性淋巴细胞白血病（ALL）时，白血病细胞呈阴性反应

（二）中性粒细胞碱性磷酸酶染色

1.原理

    中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的显示方法有偶氮偶联法和钙钴法两种。前者的染色原理是血细胞内碱性磷酸酶在pH为9.4～9.6的条件下，将基质液中的α磷酸萘酚钠水解，产生α萘酚与重氮盐偶联形成有色沉淀，定位于细胞质内酶活性所在之处。

2.结果

（1）NAP主要存在于成熟阶段的中性粒细胞。

（2）阳性反应为胞质中出现灰色到棕黑色颗粒，反应强度分为5级。

（3）反应结果以阳性反应细胞百分率和积分值来表示。

3.参考值

（1）成人NAP阳性率10%～40%；积分值40～80分。

（2）由于各实验室条件不同，参考值也有差异。

3.临床意义

（1）感染性疾病  细菌性感染时NAP活性明显增高；病毒性感染时其活性在正常范围或略减低。

（2）慢性髓系白血病的NAP活性明显减低，积分值常为0；细菌感染引起的类白血病反应的NAP活性极度增高。

（3）急性粒细胞白血病时NAP积分值减低；急性淋巴细胞白血病的NAP积分值多增高；急性单核细胞白血病时一般正常或减低。

（4）再生障碍性贫血时NAP活性增高；阵发性睡眠性血红蛋白尿症时活性减低。

（5）其他血液病：一些成熟淋巴细胞的肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性肿瘤等NAP活性中度增高。

（6）腺垂体或肾上腺皮质功能亢进，应用肾上腺皮质激素、ACTH、雌激素等NAP积分值可增高。

（三）氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色

1.原理

血细胞中的氯乙酸AS-D萘酚酯酶能将基质液中的氯乙酸AS-D萘酚水解，产生萘酚AS-D，后者与重氮盐GBC偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内。

2.结果   胞质中出现红色沉淀者为阳性反应。

3.临床意义

（1）急性粒细胞白血病时原始粒细胞和早幼粒细胞酶活性明显增强，AS-D NCE染色呈强阳性反应

（2）急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病时均呈阴性反应

（3）急性粒、单核细胞白血病时，部分白血病细胞（粒系）呈阳性反应，而有些白血病细胞（单核系）呈阴性反应

（四）α乙酸萘酚酯酶染色

1.原理    α乙酸萘酚酯酶能将基质液中的α乙酸萘酚水解，产生α萘酚，再与重氮染料偶联，形成不溶性的有色沉淀，定位于胞质内。

2.结果    α乙酸萘酚酯酶主要存在于单核系细胞中，胞质中出现有色沉淀者为阳性反应。

3.临床意义

（1）急性单核细胞白血病细胞呈阳性或强阳性反应，但单核细胞中的酶活性可被氟化钠（NaF）抑制。

（2）急性粒细胞白血病时，呈阴性反应或弱阳性反应，其阳性不被氟化钠抑制。

（3）本染色法主要用于急性单核细胞白血病与急性粒细胞白血病的鉴别。

（五）糖原染色

1.原理

过碘酸能将血细胞内的糖原氧化生成醛基，醛基与Schiff液中的无色品红结合，形成紫红色化合物，定位于胞质内。

2.结果

（1）胞质中出现红色者为阳性反应。

（2）阳性反应物可呈颗粒状、小块状或弥散均匀红色。

3.临床意义

（1）纯红白血病与其他良性红细胞疾病的鉴别     纯红白血病时幼红细胞呈强阳性反应，严重缺铁性贫血、重型海洋性贫血及巨幼细胞贫血，部分病例的个别幼红细胞可呈阳性反应。

（2）急性白血病细胞类型的鉴别

Ø  急性粒细胞白血病，原始粒细胞呈阴性反应或弱阳性反应，阳性反应物质呈细颗粒状或均匀淡红色

Ø  急性淋巴细胞白血病原始和幼稚淋巴细胞常呈阳性反应，阳性反应物质呈粗颗粒状或块状

Ø  急性单核细胞白血病原始、幼稚单核细胞大多为阳性反应，呈弥散均匀红色或细颗粒状

（3）其他

Ø  巨核细胞PAS染色呈阳性反应，有助于识别不典型巨核细胞，如急性巨核细胞白血病和MDS中的小巨核细胞

Ø  Gaucher细胞PAS染色呈强阳性反应，有助于与Niemann-Pick细胞鉴别

Ø  骨髓转移的腺癌细胞PAS呈强阳性反应

五、血细胞的细胞化学染色

几种常见急性白血病的细胞化学染色结果

	急性淋巴细胞白血病	急性粒细胞白血病	急性单核细胞白血病	纯红白血病
MPO	-	+～+++	-～+	-
AS-D  NCE	-	++～+++	-～+	同上
αNAE		-～++	++～+++	同上
αNAE+NaF		不被NaF抑制	能被NaF抑制	同上
NAP	增加	减少	正常或增加	同上
PAS	+，粗颗粒状或块状	-或+，弥散性淡红色	-或+，弥散性淡红色或细颗粒状	+++

（六）铁染色

1.原理

含铁物质在酸性条件下与亚铁氰化钾反应，生成蓝绿色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，此染色法又称为普鲁士蓝反应。

2.结果

（1）细胞外铁  观察骨髓小粒中贮存在单核-巨噬细胞系统内的铁（在幼红细胞之外的铁）。

阳性反应为骨髓小粒上见到的呈蓝绿色均匀的无形物质，或呈蓝绿色的小珠状、粗颗粒状或蓝黑色的小块物质。铁染色细胞外铁阳性反应的强度分为5级：

“-”骨髓小粒无蓝绿色显现（提示骨髓贮存铁缺乏）。

“+”有少量铁颗粒，或偶见少量铁小珠。

“++”有较多的铁颗粒和铁小珠。

“+++”有很多铁颗粒、小珠和少数蓝绿色小块。

“++++”有极多的铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块。

（2）细胞内铁

Ø  为幼红细胞内的铁，含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼红细胞。

Ø  正常幼红细胞（主要是晚幼红细胞）的细胞核周围可见到1～5个呈蓝绿色的细小铁颗粒。

Ø  在油浸镜下连续计数100个幼红细胞，记录铁粒阳性的幼红细胞数，即为铁粒幼细胞所占的百分率。

Ø  含蓝绿色铁粒在5个以上，并环绕细胞核排列1/2周以上者，称为环形铁粒幼红细胞。

3.参考值

（1）细胞外铁+～++，大多为++。

（2）细胞内铁20%～90%，平均值为65%，无环形铁粒幼红细胞。

（3）由于各实验室的实验条件不同，此参考值也有差异。

4.临床意义

（1）缺铁性贫血 ：早期骨髓中贮存铁就已耗尽，细胞外铁呈“-”。铁粒幼细胞百分率减低，常<15%，甚至为“0”。铁染色是目前诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一项可靠和临床实用的检验方法。

（2）非缺铁性贫血 ：如慢性炎症性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、铁粒幼细胞性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞贫血等，细胞外铁多增加，常> +++～++++。

（3）铁粒幼细胞性贫血：因血红素合成障碍，铁利用不良，铁粒幼红细胞增多，可见到环形铁粒幼红细胞，占幼红细胞的15%以上。

（4）骨髓增生异常综合征（MDS）伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS），环形铁粒幼红细胞>15%。

六、细胞免疫分型

（一）检测方法

1.免疫荧光法

（1）原理：用荧光素标记的单克隆抗体，在一定条件下与细胞表面的分化抗原相结合，经激发光照射则发荧光，借助于荧光显微镜或流式细胞仪观察荧光显示抗原。

（2）参考值：有荧光者为阳性细胞，无荧光者为阴性细胞。

2.免疫酶标染色法    以APAAP（抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶）法为例

将鼠源性识别能识别某抗原的抗体（一抗）与检测细胞相结合，抗鼠IgG抗体（二抗）作为桥梁，连接鼠源性的抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物，形成Ag-Ab1-Ab2-anti AP-AP的复合物。

（二）细胞免疫分型的临床应用

1.有助于识别不同系列的细胞

（1）识别髓系细胞的抗体：CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD33、CD64、CD117；

（2）识别T细胞系列的抗体：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD57；

（3）识别B细胞系列的抗体：CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、FMC7、CD79a、IgM、Kappa和Lambda轻链等；

（4）识别NK细胞的抗体：CD16、CD56、CD57等。

（5）识别巨核细胞和血小板的抗体：CD41、CD42、CD61等。

（6）识别幼稚红细胞的抗体：血型糖蛋白A（CD235a）、CD36、CD71。

2.用于检测T淋巴细胞亚群

临床上常用CD3、CD4和CD8单抗检测全T（CD3）细胞，并可将外周淋巴器官和血液中T细胞分为Th（CD4⁺，CD8^-）和Ts（CD4^-，CD8⁺）两个主要亚群。

3.用于识别不同分化阶段的细胞

检测细胞表达CD34、CD38、HLA-DR、TdT状况可了解细胞的分化阶段。

4.有助于识别不同功能状态的细胞

记忆T细胞高表达CD45RO、不表达CD45RA。活化T细胞不表达CD45RA。

5.可用于各种血液肿瘤的免疫表型分析

6.可用于血液肿瘤微小残留病的检测

（三）急性白血病细胞免疫表型特点

七、细胞遗传学及基因分析

（一）血液肿瘤的染色体分析

血液肿瘤的染色体异常分为平衡畸变和不平衡畸变。

1.AML平衡畸变主要是易位或倒位，其结果产生融合基因，约占60%。

例如：t(8；21) ( q22；q22)见于一些AML，t(15；17) (q22；q12)见于急性早幼粒细胞白血病（APL）。

2.AML的染色体非平衡畸变多表现为染色体数目异常、染色体整条或部分丢失或增加，最多见是+8、-5/5q-、-7/7 q-、20 q-、+21等。

3.部分急性淋巴细胞白血病或母细胞淋巴瘤也存在染色体的异常。

（二）血液肿瘤基因分析

血液肿瘤的染色体易位在分子水平的改变，表现为与血液肿瘤发病机制有关的基因重排及各种融合基因的形成，是可靠的分子标志。

1.APL存在t（15；17）（q22；q12）的特异性染色体异常，形成PML-RARA及RARA-PML两种融合基因。

2.t(8；21)(q22；q22)的易位导致21q的急性粒细胞白血病基因（AMLl）重排和8q上的MTG8

（ETO）基因融合形成RUNX1-RUNX1T1融合基因。

3.CML具有ph染色体，即t（9；22）（q34;q11.2），形成bcr-abl融合基因，其基因产物P210具有较高的蛋白酪氨酸激酶活性（PTK），现被认为是引起血细胞癌变和髓系细胞无限增殖的主要原因。

（三）具有重现性遗传学异常的急性白血病和淋巴母细胞淋巴瘤

考试无捷径、学习有方法