RAS变矣 可成药否

之前关于靶向RAS,请参考推送:将军三箭定天山 不克RAS誓不还

近期基因泰克的Shiva Malek及合作伙伴在Nature Reviews Drug Discovery发表了题为《RAS- targeted therapies: is the undruggable drugged?》的综述,有些有意思的变化,分享给大家:

RAS(KRAS、NRASHRAS)是肿瘤中最常见的突变基因家族,因此近30年来研究人员也为寻找有效的RAS抑制剂而苦苦探索了30载。即便在10年以前,RAS抑制剂也是很难开发,因为RAS也被打上了不可成药的标签。但现在随着靶向NSCLC中最主要的突变类型KRASG12C的等位基因特异的共价抑制剂的成功开发,使得我们有机会来评估RAS驱动的肿瘤的最佳治疗策略。突变本身的生化特征和肿瘤原发病灶都有可能会影响这类治疗的效果。现在通过等位基因特异抑制剂来直接靶向抑制RAS成为首选的治疗选择,而靶向RAS活化通路或RAS效应通路的策略可以和直接的RAS抑制剂、免疫检查点抑制剂、靶向T细胞的疗法联合来治疗RAS突变的肿瘤。这里回顾了靶向RAS突变蛋白的治疗的进展,并讨论了包括联合策略在内的这些疗法在将来的挑战。


正文

1 RAS突变及剪接变体

2 RAS突变的生化特征

3 直接靶向RAS的方法

3.1 靶向KRAS-G12C的共价抑制剂
3.2 其他突变特异性的靶向策略
3.3 RAS效应蛋白相互作用抑制剂

4 非直接靶向RAS的策略

4.1 核苷酸交换循环抑制剂
4.1.1 SOS1抑制剂
4.1.2 SHP2抑制剂
4.2 RAS加工抑制剂
4.3 RAS寡聚和效应子结合
4.4 靶向RAS信号通路
4.4.1 合成致死筛选
4.4.2 EGFR家族疗法 
4.4.3 MAPK通路:RAF抑制剂 
4.4.4 MAPK通路:MEK抑制剂
4.4.5 MAPK通路:ERK抑制剂
4.4.6 PI3K通路抑制剂 

5 新兴疗法

5.1 小干扰RNA疗法 (siRNA疗法)
5.2 自吞噬 
5.3 免疫疗法

5.3.1 免疫检查点抑制剂 

5.3.2  过继细胞疗法 

5.3.3 肿瘤疫苗 

6 未来发展方向与小结


正文

RAS(KRAS、NRAS和HRAS)是肿瘤中最常见的突变基因家族,而KRAS的突变也引起包括肺癌、肠癌和胰腺癌这三种最常见的肿瘤。三十年来致力于开发有效的疗法来抑制RAS驱动的肿瘤的努力也多以失败告终,因此RAS也被认为不可成药(undruggable)。但是随着近来FDA授予等位基因特异的共价抑制剂AMG 510快速通道资格认定(FTD),这个获批临床的针对特定的KRAS突变的疗法开始进入大家视线。AMG 510结合并成功抑制NSCLC中最常见的RAS突变类型KRAS-G12C,也提高了靶向治疗更多的RAS突变类型的希望。

在正常的细胞中,RAS处于如EGFR这种生长因子受体的下游,是一类分子开关的小GTPase,在结合GTP的活化形式和结合GDP的非活化形式间切换。尽管RAS能内源性的水解GTP和交换核苷酸,但是细胞信号主要还是靠鸟苷酸交换因子(GEF)催化加载GTP来活化,通过GTPase活化蛋白(GAP)加速GTP的水解来触发信号通路的失活。在结合GTP的状态下,RAS可以通过直接作用并活化包括MAPK和PI3K通路在内的多条下游效应通路。RAS突变通常能破坏鸟苷酸交换,能够非GAP依赖的将RAS锁定在结合GTP的活化状态,因此可以持续活化下游信号通路来引发肿瘤细胞的增殖。

在这份综述中,我们介绍在近来在针对突变的RAS蛋白的靶向治疗的开发上的进展并讨论了潜在可能提升临床效果的联合治疗策略:1)首先讨论了不同的RAS突变类型及生化性质上的差异;2)然后回顾了近来的直接或间接地抑制RAS的策略,特别重点介绍靶向KRAS G12C的突破性疗法及阻断SOS1、SHP2的抑制剂;3)更新了靶向RAS自身及下游信号通路中效应蛋白的的抑制剂的临床进度;4)最后详细列举了治疗RAS突变的肿瘤的新策略。

1 RAS突变及剪接变体

RAS突变是包括结直肠癌、胰腺导管腺癌、肺腺癌、黑色素瘤和特定血液肿瘤在内的多个癌种的遗传驱动因子。虽然上述肿瘤都可由RAS突变驱动,但是RAS异构体类型(KRAS、NRASHRAS)、突变密码子及突变频率因组织类型而差异很大。比如大部分的肺腺癌、胰腺导管腺癌(PDAC)和结直肠癌由KRAS突变驱动,分别占到32%、86%和41%,其中最主要的是密码子12位的突变,分别85%、91%和68%。对比之下,29%的黑色素瘤由NRAS而非KRAS的突变驱动,这些突变85%通常发生在密码子第61位。HRAS突变发生的频率通常低于KRASNRAS,但特定亚型的头颈癌(5%)和膀胱癌(6%)是由HRAS突变驱动,通常也是发生在第12和61位密码子。基因工程小鼠模型(GEMMs)能够重现在患者中发现的RAS家族成员突变及密码子突变偏好。例如在结肠上皮细胞中Kras G12D表达可以引起过度增殖,但是在这类细胞中Nras G12D表达却不能影响增殖。而在黑色素细胞中只有表达Nras Q61R而非Nras G12D才能诱导黑色素瘤发生。所以如果采取针对RAS突变的治疗必须考虑到不同的家族成员和特定的密码子突变。

KRAS基因编码了2种不同的剪接变体:KRAS4AKRAS4B,采用了不同外显子4。其中KRAS4A在C端着额外的22-33氨基酸序列,因此有着不同的翻译后修饰和膜定位;而KRAS4B被认为是主要形式,因此在肿瘤细胞中普遍的高表达。近来发现KRAS4A也在肿瘤细胞株中广泛表达,而且在结直肠癌细胞中表达水平与KRAS4B接近。KRAS4A在GEMMs中并不重要,敲除外显子4A后胚胎已经可存活——但敲除整个Kras却能因此胚胎致死。近来发现Kras4B基因在小鼠中也是不重要,提示这两种变体在发育中可能是功能冗余。但是敲除掉Kras4AKras4B中任意一个都能引起对肺肿瘤转化的抵抗,提示两种变体对肿瘤发生来说缺一不可,它们在肿瘤微环境中也有着特定的功能——KRAS4A的表达提升了对缺氧等压力的适应;而KRAS4B更多的在干细胞及祖细胞中表达。肿瘤在压力下可以通过剪接表达KRAS4A来适应,这些近来的研究更新了KRAS4A在肿瘤发生中的角色,同时由于要考虑KRAS4A也会改变KRAS抑制的视角。

2 RAS突变的生化特征

像RAS这样的小GTPase蛋白在结合GDP的非活化态与结合GTP的活化态之间转化。SOS这样的鸟苷酸交换因子(GRE)或是鸟苷酸释放蛋白能够促进将GDP替换为GTP;而像NF1及p20GAP这样的GTPsae活化蛋白(GAP)则通过刺激GTP水解使得RAS回到结合GTP的非活化形式。RAS密码子12、13级61位的突变会破坏GAP介导的GTP水解,使得这些突变体都聚积在结合GTP的活化状态,从而进一步激活下游的MAK或PI3K在内的多条效应通路促进细胞的增殖。

内源性的GTPase或许和GDP-GTP交换速率在不同的RAS突变体之间差异很大,这也为针对各个突变寻找最佳的靶向策略提供支持。例如,密码子12、13和61的突变通常降低了内源的GTPase活性,KRAS-G12C虽然例外,呈现了近乎野生型的内源GTPase活性,但是降低了p12-GAP介导的水解速率。因此Shokat和他的同事基于KRAS-G12C这个独特的生化特征来设计共价抑制剂来靶向结合GDP的KRAS。相反,KRAS G13D相比野生型有着明显升高的交换速率,也就意味着结合GDP的时间很短。所以某种程度上KRAS中13位密码子突变对NF1介导的水解更敏感,而12或61位密码子的突变相对不敏感。更有意思的KRAS第13位密码子突变常伴随着NF1的突变,进一步证明肿瘤有着克服KRAS G13和NF1活性的进化选择压来保持着更高的生化活性。不同突变的生化性质差异决定了那种核苷酸结合状态更适合拿来设计等位特异性抑制剂,而低GTPase活性以及高的鸟苷酸交换将回来靶向结合GDP的形式带来困难。

3 直接靶向RAS的方法

直接抑制RAS是治疗RAS突变的肿瘤的理想策略,这里我们重点介绍了近期的一些进展,包括switch-II突变选择性的共价抑制剂和pan-RAS抑制剂的开发。

3.1 靶向KRAS-G12C的共价抑制剂

Kras基因对于小鼠发育十分关键,而NrasHras并不是必需。如果人中对KRAS的需求也是类似,那么靶向野生型KRAS蛋白就会引发毒性的担心。但是当Kras替换成Hras后,小鼠也是可以存活的,这也在某种程度上降低毒性的担心。成年小鼠中条件性敲除Kras后直接解释这些担心,但是目前这类研究尚未发表。这个领域的RAS抑制剂的开发主要有Shokat及其同事引导,主要集中在KRAS-G12C的共价抑制剂开发上,期望可以比变抑制全部的RAS异构体引发的毒性。

KRAS-G12C上突变的12位密码子——半胱氨酸(Cys)本身固有的反应特点可以拿来研发共价结合的小分子抑制剂。共价靶向活性位点的半胱氨酸也是药物发现中常采用的策略。更重要的是,野生型KRA

Shokat最早在KRAS-G12C中鉴定出switch-II后面的一个全新的别构结合口袋,即switch-II口袋,并开发出一系列不可逆的的结合KRAS G12C的化合物。这些化合物结合KRAS-G12C结合GDP的形式,并且组算了SOS催化的核苷酸交换并阻断了KRAS-G12C与下游RAF的结合。需要指出的是,这些化合物只结合KRAS-G12C结合GDP的状态,因此需要KRAS-G12C陷阱里GTP的水解。稳态下75%的KRAS G12C处于结合GTP的状态(破坏了GAP水解),但是KRAS-G12C在诸多突变中有着最高的内生GTPase活性,因此最易收到共价化合物的结合。由于KRAS中除了G12C以外的突变内源GTP水解速率耕地,所以尚不清楚其他的突变类型中采用同样的靶向switch-II口袋的策略是否也可以成功。

多家公司也在开发针对KRAS G12C的更强效的抑制剂,其中几个已经处于临床——尽管发表的数据很少。AMG510是首个进入临床的该类分子,初步的1期结果还是比较振奋(NCT03600883):特别在NSCLC中,13例患者接受了960mg QD的治疗后,7例获得PR,6例获得SD;而在CRC中的结果则不那么显著,12例患者中只有1例PR及10例SD。所幸的是,该研究34例患者没有报道DLT或是导致治疗终止的AE。而在临床前模型中,AMG510可以专门只强效的抑制KRAS G12C细胞株的生长(IC50 6-9nM),并在移植模型中引起肿瘤退化。当AMG510与激活RAS或RAS激活的蛋白(如EGFR、SHP2或MEK、AKT、PI3K)的抑制剂或是免疫治疗联合后,有着明显协同增强的抑制效应。

MRTX849同样也处于临床I/II期(NCT03785249),早期研究中,患者接受600mg BID治疗后,5例NSCLC患者中2例报道PR,而2例NSCLC患者中1例报道PR。而在临床前模型中,MRTX849也能专门只强效的抑制KRAS G12C细胞株的生长(IC50 94-107nM)并在移植模型中引起肿瘤退化。当与EGFR、SHP2、mTOR及CDK4/6抑制剂联合后,MRTX849也呈现出协同增效的结果——甚至在MRTX849难治的肿瘤中也是如此。在一项CRISPR筛选中,敲除了NRAS或KEAP1引起了对MRTX849的抵抗,而敲除SHP2MYC2mTOR通路的基因则会增强对MRTX849的敏感性。

第三个KRAS G12C的共价抑制剂JNJ-74699157(ARS-3258)目前也处于临床1期(NCT04006301),结果还未发表。但是两个前化合物ARS-853和ARS-1620可以特异的在携带KRAS G12C突变的肿瘤细胞株中减弱细胞增长并抑制下游MAPK信号同路。第四个KRAS G12C共价抑制剂LY3499446也处在临床I/II期(NCT04165031) :包括单药及联合了CDK4/6、EGFR或化疗(多西他赛)的联合方案,结果尚未发表。

上面讨论的这类共价抑制剂需要KRAS G12C处于结合GDP的形式,但是会出现耐药突变来促进从GDP到GTP的交换,通过CRISPR筛选,鉴定出可能的突变机制包括NF1或是其他RAS异构体(NRASHRAS)的缺失。

近来发现一些新的分子可以靶向GDP结合状态和结合GTP结合状态的KRAS。这些分子通常结合switch-II口袋附近但是远离核苷酸结合口袋的新的沟(switch-II groove),这个发现指出了switch-II口袋动态变化的重要性,同时也为抑制剂可同时靶向两种核苷酸结合态的RAS提供了概念验证的证据。

3.2 其他突变特异性的靶向策略

如上所述,KRAS G12C只占了KRAS突变的一小部分,而且主要还是在肺腺癌中。为了有效的抑制G12D和G12V在内的其他常见的KRAS突变,针对这种缺少活性半胱氨酸的突变也需要不同的策略。由于不同的突变之间处于不同核苷酸结合状态的比例不同,因此设计开发突变特异性抑制剂的时候需要考虑到生化性质的差异并评估靶向哪种状态(结合GDP or GTP)。

Revilution Medicine开发了RAS(ON)的三元复合物平台:一个化合物可以介导包括KRAS G12C在内的多个KRAS突变体与分子伴侣亲环素A(cyclophilin A)的非天然的蛋白-蛋白相互作用,这类复合物的形成可以阻断KRAS突变体结合SOS和能结合RAS的下游效应蛋白。更有意思的是,这些分子(RM-007和RM-008)可以共价结合GTP结合态的G12C和G13C,并且有着抗细胞增殖的活性。由于靶向GTP结合态的分子可以破环经典的GTP构象并阻断效应蛋白的相互作用,因此这样的策略可以克服可能的针对KRAS-G12C GDP结合态抑制剂的耐药。

3.3 RAS效应蛋白相互作用抑制剂

尽管KRAS G12C抑制剂对于靶向突变特异的状态来说是有效的,但是要针对每个突变的RAS蛋白来筛选有效的治疗又显得繁琐。直接靶向所有种类的RAS蛋白(KRAS4A、KRAS4B、NRAS 和 HRAS)中保守的配体结合位点可能给抑制跨癌种和覆盖各个突变类型的RAS提供了一种策略。其中的一个化合物3314,结合到switch-I中保守的Asp38,阻断了与效应蛋白的结合。化合物3144能在体外结合野生型的KRAS、NRAS和HRAS,也能在体内一直KRAS G13D突变肿瘤的生长,但是同样也报道了毒性和脱靶活性。事实上由于RAS对于正常细胞信号来说十分关键,pan-RAS抑制剂不太可能有好的可耐受性。敲除所有的三个RAS异构体引起小鼠模型中的胚胎致死,在体外试验中也观察到细胞增殖信号的消失。

一个结合早期RAS的小分子DCAI,能够微弱的抑制SOS1介导的核苷酸的交换,与KRAS的共结晶显示DCAI结合在第2个α螺旋和核心的第1-3个β折叠之间的口袋里——称作DCAI口袋,从而阻断了KRAS和SOS1的结合。因为结合到DCAI口袋的小分子可以阻止SOS1介导的鸟苷酸交换,因此RAS蛋白无法变成结合GTP的活化态,,使得这个口袋成为有希望的药物靶点。

两个化合物,Acd-和Ch-,可以可逆的结合到RAS的DCAi口袋,抑制剂CRAF、RalGDS及PI3K中具有催化活性的p110α、p110γ亚基与突变型KRAS、NRAS及HRAS的结合。第三个化合物BI-2852也结合到DCAI口袋,下调了SOS1介导的交换,从而降低了下游激酶ERK和AKT的磷酸化。

DCAI口袋同样存在于RAS蛋白,因此这些化合物可以作为pan-RAS抑制剂发挥功能,因此并没有突变选择性。由于pan-RAS抑制剂的毒性问题,后续需要进一步对突变的选择性进行优化。

4 非直接靶向RAS的策略

正常的RAS活化需要核苷酸交换、处理、膜定位和效应蛋白结合,改变其中任意的关键步骤可以用来间接的抑制RAS的活化。

4.1 核苷酸交换循环抑制剂

4.1.1 SOS1抑制剂

最初寻找阻断GEF对RAS的活性筛出了一个结合KRAS的位点在switch-I和switch-II之间小分子,Kd值大约190μM,因此可以抑制SOS1的结合及SOS1介导的核苷酸交换。后续尝试用一段模拟正构SOS1螺旋的分子来抑制SOS1-RAS的相互作用。尽管这个分子可以纳摩尔级的亲和力结合SOS1,但是细胞活性很低。随后这个领域转向寻找SOS1的小分子抑制剂,随后3个团队筛到了结合到SOS1中CDC25结构域以及RAS-SOS1-RAS三原复合物中RAS的switch-II附近的小分子。有意思的是,这些小分子的结合可以活化或抑制SOS1-RAS的相互作用。其中一个研究组筛出了小分子抑制剂BAY-293,能够在纳摩尔水平抑制SOS1-KRAS的相互作用,但是抑制KRAS突变的细胞增殖效应较弱(IC50=3μM),而抑制KRAS野生型细胞的效应较强(IC50=1μM)。BAY-293与KRAS G12C共价抑制剂ARS-853在KRAS-G12C突变的细胞株中显示了协同的生长抑制效应,提示SOS1抑制剂可以和结合GDP的KRAS-G12C抑制剂联合——SOS1抑制可以增加非活化态的KRAS-G12C水平。现在SOS1抑制剂BI01701963的单药及联合MEK抑制剂曲美替尼的1期临床正在进行中(NCT04111458)。

4.1.2 SHP2抑制剂

SHP2是一个非受体的蛋白酪氨酸磷酸酶,对于MAPK通路的完全活化是必需的。编码SHP2的PTPN11基因的突变能够引起RASopathies,并存在于在50%的Noonan综合症患者中。虽然SHP2的功能还存在未知的地方,但现在的模型中SHP2作为一个骨架蛋白,结合到GRB2和SOS1,从而促进核苷酸的交换。SHP2的抑制可能和SOS1抑制剂功能类似,阻断了野生型KRAS加载GTP。KRAS突变的肿瘤对SHP2有依赖:肿瘤模型中敲除Ptpn11可以延缓肿瘤的增长,但是不能引起消退。

通过化合物文库筛选得到的SHP-099可以将SHP2锁定在自我抑制的构象,能够强效的别构抑制SHP2(

IC50=0.071μM)。在KRAS G12D突变的PDAC及NSCLC的PDX模型中,SHP-099与MEK抑制剂曲美替尼联合后能够协同性的抑制细胞增殖,但是在KRAS G13D的细胞株对SHP-099并不敏感。

RMC-4550是一个强效的、选择性SHP2别构抑制剂,结合位点与SHP-099相同并能稳定在SHP2的自抑制构象。RMC-4550处理后可以降低细胞增殖,但这种效应只在12位密码子突变的细胞中比较明显,而13或61位密码子突变的细胞中并没观察到。KRAS G12C突变的细胞中观察到的敏感性最强,而G12D、G12V突变中观察到的敏感性比较弱。这些发现也强调了各个突变的生化性质决定了依赖于RAS活性的鸟苷酸交换,内源性或GAP介导的GTP水解升高的突变某种程度上对SHP2抑制更敏感。

衍生自RMC-4520的临床候选药物RMC-4630目前启动了单药的临床I期(NCT03634982)和联合MEK抑制剂Cobimetinib的Ib/II期临床(NCT03989115)。另一个SHP2异构抑制剂JAB-3068也处于临床I/II期,但尚无结果发表(NCT03518554, NCT03565003)。 第三个SHP2抑制剂TNO-155也启动了单药的临床I期(NCT03114319)和联合MRTX-849的临床I/II期(NCT04330664)。这些研究都尚无结果发表。

4.2 RAS加工抑制剂

RAS只有定位到细胞膜才有活性。要结合到细胞膜,RAS需要3个翻译后酶催化的加工步骤:1)法尼基转移酶(FTase)或香叶袭氨基转移酶(GGTase)催化CAAX box的异戊烯化;2)RAS转化酶(RCE1)切除末端的AAX残基;3)异肾素半胱氨酸羧基甲基转移酶(ICMT)催化了CAAX box中半胱氨酸的甲基化。因此抑制RAS的加工可以阻止结合细胞膜和下游RAS信号。

尽管FTase抑制剂(FTI)临床上在KRAS突变的肿瘤中结果让人失望,可能因为FTase和GGTase间的功能冗余,但是临床上重新关注FTI在HRAS突变的肿瘤中的使用。与KRAS及NRAS 不同,HRAS专门由FTase异戊烯化,因此FTI处理HRAS突变的肿瘤是有用的。事实上,也在携带HRAS突变的HSNCC和NSCLC的PDX中观察到对FTI tipifarnib的应答。Tipifarnib目前正在开展针对HRAS突变的HNSCC和甲状腺癌的II期临床(NCT02383927)。已经报道的结果中,6例接受Tipifarnib治疗的患者中4例PR,2例SD。

KRASNRAS突变的肿瘤中避免GGTase对FTase的补偿作用的一个策略就是同事靶向下游的RAS加工酶RCE1和ICMT,这两个酶在KRAS突变而非KRAS野生型的细胞中十分关键。相反,FTase的β亚基不管在KRAS野生型还是突变的细胞中都很关键,因此酶活完全活性就会在所有的细胞中引起致死。因此抑制剂RCE1或ICMT可能会提供突变选择性并降低FTI的毒性。

ICMT的小分子抑制剂cysmethynil(IC50=2.4 μM)破坏了RAS结合到膜,能够体外(EC50=20μM)及体内降低RAS突变的细胞株的生长。进一步修改cysmethynil后可以提升抑制ICMT的效果但是却变得不能抑制细胞生长。迄今为止最强效的ICMT抑制剂(IC50=1.3μM)只能轻微的降低细胞增殖(EC50=0.3-10+μM)。近来发现的UCM-1336(IC50=2μM)可以破坏全部4种RAS异构体结合到细胞膜,同样也能在体外(EC50=2-12μM)及体内抑制RAS突变的细胞的增殖。UCM-1336在结构上与衍生自cysmethynil的化合物完全不同,但仍需要进一步优化以增强疗效。目前尚未鉴定出强效的、选择性的RCE1抑制剂。

经历翻译后修饰的RAS定位和运输由结合到法尼基化的RAS的异戊二烯基结合蛋白的磷酸二酯酶δ(PDEδ)调控。小分子Deltarasin结合到PDEδ的法尼基结合口袋,阻止了KRAS的结合(Kd=7.6 nM),产生了KRAS的错位分布,最终降低了细胞增殖。随后计算机Docking筛到另一个化合物NHTD,阻止了KRAS结合到PDEδ。NHTD可以在体外和体内抑制KRAS突变的肿瘤细胞的生长(EC50=2-7μM),但是并没有Deltarasin相关的毒性事件。

需要指出的是,讨论的这些酶同样加工其他结合细胞膜的蛋白,可能会引起脱靶效应,因此直接抑制剂RAS可能是现在最强的治疗策略。

4.3 RAS寡聚和效应子结合

一经有效加工,RAS蛋白就定位到细胞膜并形成寡聚或二聚体——这对RAS驱动的信号来说是必需的。RAS蛋白被发现可以按异构体特异的形式组装成5-9个蛋白形成的纳米簇,对于下游信号的激活非常关键。近来RAS的二聚化成为了RAS自结合来增加骨架形成和信号活性的另一类机制。

很难在体外构建RAS二聚体或寡聚体特别是用翻译后修饰的RAS和脂膜或Nanodiscs(纳米磷脂盘)重新构建。由于缺少最终的结构与生化数据,大部分致力于RAS-RAS相互作用的分子界面的研究局限于计算建模和实验验证,同样也包括借助PDB数据库里数以百计的RAS的晶体堆积作用。尽管鉴定出并验证了多个界面,很多计算和实验的研究都聚焦于RAS二聚化中的单个界面,也就是第4和5个α螺旋形成的界面(α4–α5),这同样也是很多HRAS、KRAS和NRAS结构中最主要的一个晶体堆积作用。

纳米抗体NS1可以靶向上文提到的α4–α5界面,通过直接结合到这个界面来破坏HRAS(Kd=13nM)和KRAS(Kd=65nM)的自结合,能在不干扰RAS定位和GTPase活性的情况下减弱下游信号的活化并抑制了细胞增殖。后续需要进一步的鉴定和验证这些RAS-RAS相互作用界面,因为后来一项研究证明经过完全加工的KRAS在一连串的浓度范围内能已单体形式存在于脂膜。

最近发现的RAS自动抑制新机制:膜闭塞,为靶向RAS蛋白-蛋白互作提供了另一种潜在途径。在膜闭塞中,RAS与脂膜直接作用后将RAS的效应蛋白结合界面从细胞质中分离出来。一个小分子Cmpd2可以结合到RAS和脂膜间的界面(Kd=1μM),促进膜阻塞并减少了结合到RAF的RBD结构域。由于RAS-效应蛋白界面高度保守性,这类策略为有效抑制RAS驱动的所有下游信号通路提供了机会。

4.4 靶向RAS信号通路

靶向RAS通路有两种的不同方法:鉴定RAS突变后合成致死的基因;靶向酪氨酸激酶受体(如EGFR家族)和RAS效应通路,即MAPK和PI3K。

4.4.1 合成致死筛选

KRASNRAS突变的细胞株中,除了RAS本身,最重要的必需基因是RAF1(编码CRAF)和SHOC2。另一项研究证实RAS突变的人AML细胞株需要RAF1SHOC2

Kras G12V的小鼠肺腺癌模型中破坏Craf能显著引起肿瘤体积缩小,同时也并没有发现CRAF缺失引起任何系统性不良事件,也没有改变MAPK信号,提示CRAF可能以这种不依赖激酶的形式发挥功能。后续研究在Kras G12V的小鼠PDAC模型中同时破坏EgfrCraf能引起肿瘤的完全消退,而2个基因同时破坏后的耐受性也很好。第二个研究用了在PDAC的PDX模型同时敲除EGFRCRAF的表达同样也能减缓肿瘤。这些发现指出了抑制CRAF在治疗上的优势,提示了需要靶向CRAF的选择性的抑制剂,但是由于RAF家族激酶结构域间高度同源以及CRAF可能以不依赖激酶的形式发挥作用,因此需要新的技术方法来。

由SHOC2、MRAS和蛋白磷酸酶1(PP1)组成的磷酸酶复合体催化了RAF上Ser259的去磷酸化,这个去磷酸化可以减轻14-3-3对RAF的负调控并促进RAF的二聚化。因此SHOC2促进了RAF的二聚化,更重要的是SHOC2对于最大化ERK的活性是必需的。在Kras G12D的小鼠肺腺癌模型中破坏Shoc2能不引起毒性的同时降低肿瘤负荷、延长生存期。而在EGFRKRAS双突变的NSCLC细胞中敲除SHOC2能够减少种植模型的生长,同时引起岁MEK抑制的敏感性(包括selumetinib、曲美替尼、PD0325901 和 pimasertib)。CRISPR-Cas9筛选确定SHOC2缺失的同时用曲美替尼处理会导致合成致死。这些发现提示,SHOC2抑制剂不仅可以作为单一药物提供治疗获益,还有与MEK抑制剂联用的潜力。

4.4.2 EGFR家族疗法

有证据显示RAS与受体酪氨酸激酶中的EGFR家族存在相互作用。EGFR家族位于RAS上游,因此这些RTK失活可以减少RAS的激活。研究主要集中在EGFR的抑制,特别是治疗RAS突变的肿瘤。

靶向EGFR的西妥昔单抗和帕尼单抗都能延长KRAS等位基因野生型——同样也需要NRAS、BRAF和PIK3CA无突变的晚期CRC的OS和PFS,但是这些单抗在KRAS突变尤其是密码子12和13突变的肿瘤中无效,所以西妥昔单抗和帕尼单抗都只获批治疗KRAS未突变的晚期CRC。另外获批治疗EGFRm NSCLC的厄洛替尼和吉非替尼单药治疗KRAS突变的NSCLC也无效。

一项这对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗晚期CRC临床的回顾性研究中,分析了各个突变类型的临床获益。携带KRAS G13D突变的患者接受西妥昔单抗治疗后比KRAS其他突变有着更长的OS和PFS。另一项帕尼单抗的回顾性分析中,KRAS G13D突变的患者似乎不能从治疗中获益。一项代号ICECREAM的临床2期正在进行中,只在评估西妥昔单抗治疗KRAS G13D突变的晚期CRC的疗效(ACTRN12612000901808)。

尽管KRAS野生型的CRC会对西妥昔单抗应答,但最终晚期CRC也会对anti-EGFR治疗难治,获得性的KRAS突变就是耐药机制之一,这些突变包括KRAS扩增和体系突变(最常见的是G13D),但是不清楚这些突变是是在西妥昔单抗治疗前就存在还是治疗的结果。

敲除Egfr可以在遗传小鼠模型中抑制KRAS G12D突变的PDAC和NSCLC肿瘤。在KRAS G12D或对厄洛替尼耐药的肿瘤的早期事件都包括EGFR在内的整个EGFR家族的表达上调,如ERBB2、ERBB3和ERBB4。EGFR突变或EGFR、HER2、HER3HER4扩增的NSLCC患者的生存都很差。用FDA批准的pan-ERBB抑制剂阿法替尼或来那替尼治疗原发的KRAS G12D肿瘤,相比吉非替尼和厄洛替尼可以显著缩小肿瘤体积。现在正在开展评估来那替尼单药及联合HDAC抑制剂divalproex治疗RAS突变的实体瘤的I/II期临床(NCT03919292)。

pan-ERBB或EGFR抑制剂联合MEK或KEAS G12C共价抑制剂可以带来惊喜。阿法替尼抑制ERBB3后使得KRAS突变的CRC和NSCLC细胞对 selumetinib的MEK抑制敏感。阿法替尼或来那替尼联合MEK抑制剂去曲美替尼延长了KRAS G12D NSCLC小鼠的生存期,由于动物模型是治疗一周后监测生存期,提示联合方案带来了持续的缓解。ARS-853联合吉非替尼或厄洛替尼处理KRAS G12C细胞有显著的协同效应,厄洛替尼也降低了KRAS G12C结合GTP的比例。由于ARS 853和其他类型的KRAS G12C共价抑制剂可以结合到GDP结合态的KRAS G12C,EGFR TKI的疗效则提示:EGFR可以活化突变的RAS而抑制后降低了GTP结合态的KRAS  G12C的量,提升了疗效。

4.4.3 MAPK通路-RAF抑制剂 

结合GTP的RAS活化态促进RAF二聚化和磷酸化,从而诱导RAF激酶活性并导致RAF底物MEK1和MEK2磷酸化。磷酸化级联伴随着MEK磷酸化下游的ERK1和ERK2而继续。ERK激酶活性既激活包括ETS家族在内的促进生长的转录因子,又参与负反馈回路,此动态过程保证了MAPK信号级联的持续和强度。ERK可通过磷酸化上游SOS或CRAF,或是改变双特异性磷酸酶(DUSP)家和Sprouty(SPRY)家族的转录来抑制MAPK信号传导。DUSPs通过隔离SOS-GRB2来使ERK和SPRYs去磷酸化,从而抑制RTKs信号传导。为了有效治疗RAS突变肿瘤,必须完全抑制MAPK通路,一种策略是用针对MAPK通路组成的激酶抑制剂,并联合本综述讨论的针对其他机制的疗法。

现在BRAF V600和MEK抑制剂已经获批针对BRAF V600突变的肿瘤但是并未获批治疗RAS突变的肿瘤。临床上获批的BRAF V600抑制剂vemurafenib和dabrafenib可以诱导RAF激酶结构域中αC螺旋的外移,这些抑制剂可有效的抑制RAF单体(BRAF V600以单体传导信号)但不能用于RAS突变肿瘤,因为其中信号通过BRAF-CRAF二聚体传导。更反常的是,在RAS突变的肿瘤中,这些抑制剂可以结合野生型RAF诱导二聚化和下游MEK及ERK的磷酸化来激活MAPK信号。这种反常激活依赖于抑制剂的结合模式:而RAF二聚体抑制剂引起的激活远低于已经获批的那些BRAF V600抑制剂。

RAF二聚体抑制剂,如AZ-628、belvarafenib、LY3009120和 LXH-254结合到RAF后DFG模体在外而αC螺旋在内,可以有效的针对单体和二聚体:尽管依旧会促进二聚化,但是可以结合二聚体组分,因此这种反常的激活较少见。其中很多抑制剂都是pan-RAF抑制剂,在RAS突变和BRAF突变的肿瘤中都有活性。评估LY3009120的临床1期由于缺少临床获益而终止(只有15%的SD)。

现在,两个pan-RAF抑制剂治疗RAS突变的肿瘤处于临床1期:belvarafenib(NCT02405065, NCT03118817)和LXH-254(NCT02607813)。belvarafenib在特定的BRAF突变和NRAS突变的肿瘤中都有疗效:在6例BRAF突变的黑色素瘤中1例获得PR,在7例BRAF突变的CRC中2例获得PR,而在9例NRAS突变的黑色素瘤中2例获得PR.

4.4.4 MAPK通路:MEK抑制剂

目前有三种靶向MEK的别构抑制剂——Cobimetinib、Trametinib曲美替尼和Binimetinib获批用于治疗BRAF V600突变的黑色素瘤,但是MEK抑制剂单药治疗RAS突变肿瘤没有任何改善,因为目前也没有一种MEK抑制剂获批用于治疗RAS突变肿瘤。MEK抑制剂和RAF抑制剂一样,在RAS突变的肿瘤中都会诱导信号反馈回路,疗效较弱。

尽管MEK抑制剂单药在大部分RAS突变的肿瘤临床中都失败了,只有NRAS突变的黑色素瘤呈现一定的敏感性。例如,一项临床2期显示,20例NRAS突变的黑色素瘤患者接受binimetinib治疗后20%的患者获得了PR,基于此,一项对比binimetinib和达卡巴嗪治疗NRAS Q61突变的黑色素瘤的的三期临床正在进行中(NCT01763164)。另一项2期临床中,pimasertib相比达卡巴嗪改善了NRAS突变黑色素瘤的PFS(NCT01693068),但是不能改善整体人群的OS,所以也没获得FDA批准。相似的临床中,MEK抑制剂和标准疗法治疗KRAS突变的PDAC、CRC和NSCLC时也未能带来临床获益。在细胞水平上,NRAS突变的黑色素瘤细胞相比KRAS突变的细胞对pan-MEK抑制剂更加敏感。这种敏感性的差异需要进一步探索是由黑色素瘤本身的特征、突变的NRAS还是61位密码子突变的生化特征引起。

MEK和RAF抑制剂单药治疗RAS突变的肿瘤都无法提供临床获益,这类抑制剂现在都在进行联合治疗的探索。由于MAPK通路中反馈环路的复杂性,靶向该通路中的多个节点会持续稳定的抑制ERK磷酸化(通常是MAPK通路整体活性的测量指标)。事实也是如此,RAS突变肿瘤细胞中联合抑制MEK和RAF后有协同效应并阻断了通路的再次激活。更重要的是,在MEK抑制后诱导的MEK磷酸化和RAS中GTP的加载都需要MEK和RAF联合的协同效应。在高内源性核苷酸交换水平的KRAS突变(如KRAS-G13D)增强了GTP结合态的RAS水平,但观察到了MEK和RAF的最强协同作用:MEK抑制可引起RAF二聚化,可能有助于这种协同作用。目前有两项RAF抑制剂和MEK抑制剂联用的I期临床试验正在进行。一个Belvarafenib和Cobimetinib的联用(NCT03284502),另一个是曲美替尼和LXH-254的联用(NCT02974725)。

4.4.5 MAPK通路:ERK抑制剂

级联反应中最终的激酶ERK被抑制后可以直接降低致癌转录产物,并为对MEK或RAF抑制耐药的肿瘤提供有价值的治疗选择。ERK抑制剂的临床开发落后于MEK,BRAF单体和pan-RAF抑制剂的开发。此外,ERK抑制剂用于治疗RAS突变肿瘤的早期临床在很多都没有成功。

临床前候选药物SCH-772984有着双重的ERK抑制机制:一方面结合并抑制ERK1/2,另一方面诱导构象迁移阻断了上游激酶的磷酸化。SCH-772984处理RAS突变细胞降低了ERK磷酸化的水平和细胞增殖。临床候选化合物MK-8353相比SCH-772984改善了PK,也是类似的双重抑制剂,并能在NRAS突变的黑色素瘤模型中降低细胞增殖。但是在单药治疗的临床I期中,26例KRAS或NRAS 突变的肿瘤患者接受治疗后并没有观察到临床缓解,而在BRAF V600突变的黑色素瘤转折中观察到了3例PR。目前MK-8353联合selumetinib (NCT03745989)和K药(NCT02972034)治疗RAS突变肿瘤的临床正在进行中。

ERK抑制剂GDC-0944联合cobimetinib在KRAS突变的肿瘤模型中展现了疗效。尽管临床前的移植模型中治疗剂量会抑制肿瘤生长,但是cobimetinib联合GDC-0944的临床1期却由于患者无法耐受联合疗法而终止。当GDC-0944作为单药评估时,临床1期研究确定了RP2D为 400mg QD 用3周停1周可以耐受。在临床中14例BRAF突变的CRC和胃癌患者接受治疗后2例获得PR,7例SD剩余5例PD。而在14例KRAS突变的肿瘤患者接受治疗后只有4例SD,剩余10例PD。GDC-0944可以引起不同程度的MAPK通路抑制19-51%:相比KRAS突变的PDAC(1/4),BRAF突变的CRC中的抑制强(3/4)。后续一项临床II期在100mg QD的低剂量水平评估NRAS突变的肿瘤。

Ulixertinib(BVD-523)是一个选择性、可逆的、ATP竞争结合的ERK1/2抑制剂。近期完成的一项1期临床中,ulixertinib在NRAS突变的黑色素瘤和BRAF突变的实体瘤中显示了抗肿瘤效应 。在这项临床中,17例NRAS突变的黑色素瘤患者接受治疗后3例获得PR,6例SD剩下9例PD,尽管NRAS突变的黑色素瘤的结果还是鼓舞人心的,但是KRAS突变的肿瘤中不如人意。之前NRAS突变的肿瘤对MEK和pan-RAF抑制剂的应答也是比KRAS突变的肿瘤要好,所以KRAS突变的肿瘤还是需要进一步的评估。目前Ulixertinib联合化疗(包括吉西他滨和白紫)治疗晚期PDAC的I期临床正在进行中(NCT02608229)。

KO-947在临床前模型中有效的降低ERK磷酸化水平,治疗RAS突变及BRAF突变的NSCLC正处在临床I期(NCT03051035)。体外实验中能观察到持久稳定的应答:在单次剂量后ERK磷酸化水平抑制了5天,这些特点还是区别于其他的ERK抑制剂的,提示KO-947可能会有治疗上的优势。不过要指出的是,这种持久稳定的ERK磷酸化的抑制可能最终会引起患者的不耐受。

LY-3214996在体外也是一个对ERK1和ERK2强效的选择性的抑制剂(IC50 = 5 nM),目前也在临床I期(NCT02857270)。在剂量爬坡组,33例RAS突变和16例BRAF突变的肿瘤患者接受了LY-3214996治疗,7例BRAF突变的患者的肿瘤有了消退,2例SD,而RAS突变的患者中只有1例SD,其余全部PD。

总体而言,单药MEK、RAF或ERK抑制剂治疗RAS突变肿瘤几乎没有疗效,因此必须联合MAPK通路的其他抑制剂或其他疗法。寻找最佳组合将是一个挑战,但等位基因特异性RAS抑制剂的出现增加了可获得信号通路最大抑制的潜在组合的数量。

4.4.6 PI3K通路抑制剂 

MAPK通路一直是抑制RAS突变肿瘤的主要焦点,但RAS也激活了PI3K通路。PI3K大致分3类:I类PI3K被GTP结合态的RAS激活后,将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化成的磷脂酰肌醇-3,4,5-二磷酸(PIP3),可以将AKT招募到细胞膜进一步激活下游mTOR。I类PI3K是一个异二聚体,包括了催化亚基p110和调控亚基p85。基因PIK3CAPIK3CBPIK3CDPIK3CG分别编码了4个p110亚基异构体:p110α、p110β、p110δ和p110γ。其中p110α和p110β表达广泛,而p110δ和p110γ主要只表达于免疫细胞,另外p110β和p110γ既能被GPCR激活,也能被RTK激活。肿瘤通过PI3KCA突变、AKT扩增或PTEN(编码了将PIP3转化为PIP2的磷酸酶)缺失来上调PI3K。现在发现有趣的是,PI3K突变可以与RAS突变共存,但RAS突变通常与MAPK通路中EGFR和BRAF的突变相互排斥。这说明,RAS突变足够使MAPK而非PI3K通路失调。PI3K通路的激活通常是在化疗或MAPK通路抑制后,也就是对这两类治疗产生了抵抗。这提示MAPK和PI3K抑制的联合治疗在RAS突变的肿瘤中可能奏效。

区别于p110δ和p110γ,p110α不仅广泛表达,而且可以被RAS专门激活,所以这里着重讨论p110α抑制剂。目前有4种I类PI3K抑制剂获得FDA批准,其中alpelisib是p110α特异的抑制剂,另一个copanlisib则是pan- I类PI3K抑制剂,所有的都未批准用于治疗RAS突变肿瘤。

RAS激活PI3K和MAPK通路,并且存在重叠的反馈机制。抑制其中一条通路可导致另一条通路的代偿性激活。因此同时抑制MAPK和PI3K值得注意。临床前研究表明,PI3K和PI3K的联合抑制对于RAS突变肿瘤是有效的,而且临床上可实现。但是这些抑制剂联合在临床试验则显示不耐受的,几乎没有疗效,大概是由于毒性导致剂量下调。

为了克服这些毒性,研究聚焦于鉴定出可以使得PI3K、MAPK单个或同时被控制的RTK。其中一个例子就是胰岛素样因子1受体(IGF1R)被需要用与RAS介导的PI3K的激活。IGF1R和MEK的抑制剂在CRC和NSCLC的模型中有着协同效应。此外,小鼠模型中用KRAS G12C共价抑制剂替换掉MEk抑制剂后与IGF1R抑制剂linsitinib联合后,相比原先组合,能够显著提升疗效并改善可耐受性,这种改善需要临床评估。

目前还没有AKT抑制剂获批用于RAS突变的肿瘤,AKT和MEK抑制剂联合治疗正在进行临床,但是毒性与PI3K-MEK抑制的研究相似。mTOR抑制剂(everolimus依维莫司或temsirolimus) 联合MEK抑制剂(trametinib 或pimasertib)的可耐受性极差。

未来需要研究来寻找最佳的组合方案,p110α特异性抑制剂需要有更少的脱靶效应和更好的毒性谱。目前p110δ/p110γ抑制剂已经获批治疗CLL和SLL,这两个异构体主要表达于白细胞,因此这些抑制剂治疗RAS驱动的白血病会很有效。因此针对PI3K的治疗需要进一步评估与综述提及的其他疗法联用,例如包括KRAS G

12C在内的等位基因特异性抑制剂。

5 新兴疗法

5.1 小干扰RNA疗法 (siRNA疗法)

小鼠模型中全身系统性输送含有靶向KRAS的siRNA的纳米颗粒可能是一个针对KRAS这个靶点治疗的有效方法而且可以做到突变特异。阿斯利康开发的一款代号AZD4785的化学修饰的反义寡核苷酸,在临床前模型中经皮下注射后可以显著降低KRAS水平,但是临床试验结果并不显著(NCT03101839)。这方面需要改善药物摄取和内化并最终提升我们的认知来改善疗效。Silenseed公司对KRAS G12D突变特异的siRNA疗法siG12D-LODER,在1期临床试验中与化疗联用显示出对PDAC的希望,12例患者2例PR、10例SD(NCT01188785),而siG12D-LODER与吉西他滨+白紫联用治疗KRAS G12D的PDAC的2期临床试验正在进行中(NCT01676259)。

5.2 自吞噬 (注:这一段真是败笔)

不管是siRNA或shRNA(短发夹RNA)对KRAS表达的抑制,还是KRAS G12C抑制剂(ARS-853, ARS-1620)、MEK抑制剂 (trametinib, cobimetinib) 或 ERK抑制剂 (SCH772984)对MAPK通路的抑制都会增加自吞噬。PDAC细胞自吞噬水平升高,这些细胞需要自吞噬才能维持生长,临床前模型中通过药物抑制或者敲除自吞噬相关基因后能诱导肿瘤消退。在一项临床研究中,用FDA批准的疟疾治疗药物羟氯喹抑制自吞噬,这项单药临床在20例PDAC患者中进行,疗效非常有限,20例患者中18例出现PD。而羟氯喹术前护理联合化疗(吉西他滨+白紫)的结果比较振奋,整体缓解率和总生存都得到提升,同时血源肿瘤标志物CA 19-9水平大大降低。

尽管用羟氯喹治疗PDAC疗效有限,但在PDAC及NRAS突变黑色素瘤的临床前模型中,羟氯喹联合MAPK通路的抑制剂显示出令人鼓舞的结果。羟氯喹联合曲美替尼在移植模型和PDX模型中能够引起快速的肿瘤消退。基于这个令人鼓舞的结果,目前评估曲美替尼联合羟氯喹治疗PDAC疗效的1期临床正在进行中(NCT03825289)。

自吞噬抑制的精髓基本没有涉及:

5.3 免疫疗法

5.3.1 免疫检查点抑制剂 

目前已经有7个免疫检查点抑制剂获FDA批准,包括1个anti-CTLA4单抗(ipilimumab),3个anti-PD1单抗(nivolumab、pembrolizumab和cemiplimab)和3个anti-PD-L1单抗 (atezolizumab、avelumab和durvalumab),获批的适应症包括NSCLC和黑色素瘤,也是RAS突变主要存在的4类肿瘤中的2种。高突变负荷、高表达PD-L1和TILs升高可被用来预测免疫治疗的效果。由于有着免疫抑制微环境和低突变负荷,PDAC和CRC的免疫原性较低,所以免疫治疗在这两类肿瘤中疗效一般也就不奇怪。但是其中的一小部分MSI-H或者dMMR的患者能够对免疫治疗应答,像MSI-H在CRC和PDAC中的比例分别<15%和<20%,nivolumab和pembrolizumab也都因此获批相应的适应症。

临床上NSCLC的患者接受anti-PD-1或anti-PD-L1单药治疗时只有10-20%才会获得缓解,而突变谱能够影响对免疫治疗的缓解。单独KRAS突变的NSCLC的ORR~28.6%,同时存在LKB1突变降低了对PD-1阻断的ORR(7.4%),而同时存在TP53突变ORR择优一定提升(35.7%)。

等位基因特异的RAS抑制剂或是MAPK通路中的其他抑制剂与免疫治疗联合后可以提升RAS突变肿瘤对免疫治疗的应答。有研究表明,KRAS突变的NSCLC中PD-L1水平升高,以提高免疫逃逸。RAD突变直接上调了PD-L1表达,但是这种上调可以被曲美替尼或者选择性KRAS G12C抑制剂(ARS-853)逆转。另外在免疫活性的小鼠模型中,AMG-510处理可以诱导促炎的肿瘤微环境,增加了TILs的数量,从未与anti-PD-1处理产生协同,AMG510联合anti-PD-1或anti-PD-L1单抗治疗NSCLC的临床II期正在进行中(NCT03600883)。MEK抑制剂同样也能提高TILs的数量,在与anti-PD-1联用是也协同性的引起肿瘤消退,事实上尽管atezolizumab联合cobimetinib的组合在CRC中未能带来临床获益,但是在NSCLC的临床II期正在进行(NCT03600701)。此外还有一项正在进行中的临床1期评估anti-PD-1单抗spartalizumab和SHP2抑制剂TNO155治疗NSCLC(NCT04000529)。

5.3.2  过继细胞疗法 

第二种治疗治疗RAS驱动癌症的免疫方法就是改造免疫系统,识别突变RAS蛋白相关的特异抗原,也被称为过继细胞疗法,通过TILs或者转基因改造的T细胞,离体扩增后再回输到患者体内。TILs识别展示在肿瘤细胞表面的抗原,将扩增后的TILs输送回体内能够给黑色素瘤患者带来临床获益。随后技术发展可以改造并在外周血淋巴细胞表面表达TCRs,也能获得类似的临床获益。

由于在黑瘤中成功鉴定出肿瘤特异性抗原,相似的方法也用于鉴定KRAS突变相关的特异的抗原。在1例转移性CRC患者中鉴定能特异性识别KRAS G12D的CD8+ TILs,随后向患者输注扩增的细胞,该患者的7个肺转移病灶都有消退并且获得了长达9个月的PR。另一例研究在NSCLC患者的CD4+ T细胞中鉴定出对KRAS G12V特异特异的TCR。这些结果显示不管是KRAS G12D还是KRAS G12V来源的抗原在体内具有免疫原性。

这些抗原被用来改造T细胞,wang和合作伙伴用突变的RAS肽来免疫HLA- A*11:01转基因小鼠产生特异性识别突变的T细胞。随后在小鼠的T细胞中鉴定出TCRs,进行克隆并通过逆转录病毒转入外周血淋巴细胞刺激T细胞识别RAS G12D和G12V抗原。在肿瘤移植模型中,改造后的小鼠T细胞可以检测人KRAS突变的PDAC细胞,引起肿瘤缩小甚至完全消退。目前基于该技术,有两项分别靶向RAS-G12D和RAS-G12V的过继细胞疗法临床试验正在进行中(NCT03745326和 NCT03190941)。

5.3.3 肿瘤疫苗 

治疗RAS突变肿瘤的第三种免疫疗法方法是使用已知的RAS突变肿瘤抗原通过疫苗接种引起T细胞应答。一个类似的方法就是皮下同时注射突变的RAS蛋白的肽段和GM-CSF,刺激并激活DC并触发对突变肽段的T细胞应答。在一项I/II期中,PDAC患者接受Targovax公司开发的针对RAS突变特异的疫苗TG-01治疗,显示出患者免疫反应增强,总生存期延长(NCT02261714)246。随后其第二代疫苗TG-02治疗CRC但结果尚未发表(NCT02933944)。

第二个方法就是针对通常KRAS突变(G12C、G12D、G12V和G13D)采用mRNA编码新生抗原。肌肉注射用脂质纳米颗粒包装的mRNA疫苗,随后mRNA颗粒被APC摄入并翻译后呈递在细胞表面,诱导T细胞对突变RA新生抗原的免疫应答。目前评估该类mRNA疫苗mRNA-5671单独或者联合K药的1期临床正在进行中(NCT03948763)。

附:单药治疗的临床

联合治疗的临床

6 未来发展方向 

KRAS-G12C等位基因特异性抑制剂将改变RAS驱动肿瘤的治疗前景。这些抑制剂有望成为FDA批准的针对RAS突变型肿瘤的首批疗法,并将用于治疗RAS突变驱动的难治性肿瘤,如PDAC、CRC和LUAD。尽管这些抑制剂的开发令人振奋,但新的挑战和问题也将出现。

针对其他等位基因,如KRAS G12D和G12V的特异性抑制剂的开发仍在进行中。这些等位基因是最常见的KRAS变异,覆盖了最大一部分患者群体。最终会开发特异性抑制剂针对所有的RAS突变,为个体化治疗提供选择。靶向突变的RAS蛋白石最好治疗RAS突变肿瘤的策略,但是用于单药时疗效一般,只有和其他治疗联合才会取得更好的疗效。

至于哪种联合策略将会取得最好的疗效取决于以下几点:

  • 每种RAS变异都有独特的生化特征,这些特征将决定对不同治疗的应答。例如,SHP2抑制剂RMC-455处理KRAS G12突变的细胞非常有效,并对KRAS G12C比KRAS G12D或KRAS G12V更有效。该观察结果表明,SHP2和KRAS-G12C抑制剂的联合将是一种有效的治疗策略。开发联合策略时必须了解特定RAS密码子突变的要求和抑制剂对这些等位基因的反应。

  • 肿瘤类型会极大地影响缓解率,RAS突变的CRC和PDAC对MAPK抑制剂或免疫检查点阻断的应答率很小。AMG 510早期临床组,CRC比LUAD更难治疗,表明CRC需要使用联合疗法。CRC的治疗更需要挑战,但是BRAF V600突变的转移性CRC经binimetinib、encorafenib和西妥昔单抗三联治疗取得了令人鼓舞的疗效提示KRAS突变的CRC需要更强效的组合治疗策略来获得缓解。

  • 从历史数据来看,联合疗法更容易有毒副作用且安全性较差。然而AMG 510并未观察到DLT,并且这种突变特异性疗法脱靶作用有限。等位基因特异性抑制剂因为毒性低可以与毒性更大的其他抑制剂组合使用,而不用担心会遇到像PI3K和MEK抑制剂这两种毒性较大的化合物联合后所观察到的问题。

由于RAS突变的肿瘤的治疗将会变得越来越个性化,因此需要评估对等位基因特异性抑制剂治疗后可能出现的突变。肿瘤的异质性将会引起各种内源性的耐药机制,例如一个肿瘤中可能包含95%的KRAS G12C细胞和0.1%的KRAS G12V细胞,一旦接受KRAS G12C抑制剂治疗,将会引起肿瘤消退但最终KRAS G12V细胞会经过选择并引起复发。另外部分细胞亚群也会对KRAS G12C抑制耐药,因此肿瘤异质性也会引起内源性耐药。临床前模型无法区分肿瘤异质性,而只有临床试验中的缓解才能澄清这一点。当下关于KRASG12C特异性抑制剂治疗后出现的新生突变类型的证据很少。

现在已知的EGFR和BRAF V600抑制剂治疗后的耐药机制将会给KRAS G12C抑制剂在临床上引起的新生突变类型提供一些思路。Cys突变是其中一种常见的类型,尤其在EGFR共价抑制剂里面,但是在KRAS G12C中Cys本身就是肿瘤发生必须的,因此在临床上很少见除非突变成其他的KRAS G12等位基因(如D和V等)。包括BRAF和RAS在内的扩增是一种对BRAF V600抑制剂耐药的机制,而MET扩增也在对EGFR抑制剂的耐药中发现。而在这里,EGFR或上游EGFR家族其他成员的扩增,将会升高GTP结合态的RAS水平,引起对抑制GDP结合态的KRAS G12C抑制剂耐药。而不管是HRAS、NRAS,亦或是KRAS本身的扩增,都会升高GTP结合态的RAS水平,从而引起对KRAS G12C抑制剂的耐药。而BRAF突变肿瘤中最常见的获得性耐药机制就是NRAS或MEK1/2中的突变引起的MAPK通路的重新激活。因此有上游信号的改变(EGFR突变或扩增、RAS扩增)或下游信号的改变(RAF或MEK突变)等多种机制来重新激活MAPK通路,引起对KRASG12C等位基因特异的抑制剂的耐药。

肿瘤类型的改变,如NSCLC转化为SCLC,以及黑色素瘤中MITF的上调被认为是EGFR和BRAF V600抑制剂耐药的机制。另外上皮细胞间质转型的重编程被认为与NSCLC中EGFR及黑色素瘤中BRAF V600抑制的耐药相关。特别是,对KRAF G12C抑制相关的转录机制可以提供RAS突变之外的肿瘤细胞状态。上述耐药机制需要全新的联合策略来获得更完全持久的抑制。

破坏RAS的GTPase的突变是另一个可能的耐药机制,基于此假设,一项CRISPR筛选显示NF1的缺失促进了耐药。更重要的是BRAF V600肿瘤中NF1的缺失就表现为对vemurafenib的耐药,提示RAS突变的肿瘤可能也采取类似的机制。另外当A59G这个阻断GTPase的突变与KRAS G12C共存时,KRAS G12C主要以GTP结合态存在,等位基因特异的KRAS G12C的效果大大降低。当然尚不清楚这个机制在不同的RAS突变和肿瘤类型间是否一致。

This is an exciting time to be at the forefront of ‘drugging the undruggable’ as there is new optimism that RAS- mutant cancers can be successfully treated.

(0)

相关推荐