【生化】Angew：γ-谷氨酰转肽酶（GGT）激活的荧光探针用于持久的肿瘤成像
γ-谷氨酰转肽酶（GGT）广泛分布于肾、肝、胰腺等实质性脏器，且在几种类型的癌症中过表达，如原发性和继发性肝癌。现有的靶向GGT的荧光探针可以为这些癌症成像，但是在长时间的孵育或固定过程中，荧光水解产物会从目标癌细胞中泄漏出来。因此，需要一种新型的GGT荧光探针，其水解产物可以与目标酶以外的细胞内亲核试剂共价结合，从而可以使它们存在于细胞中而不影响目标酶的活性，既可实现敏感的癌症检测又可提供持久的信号。
基于此，日本医东京大学的Yasuteru Urano教授和日本东京大学的Mako Kamiya博士设计并合成了一种识别GGT的功能化荧光探针4-CH2F-HMDiEtR-gGlu，该探针在GGT激活过程中生成氮杂醌甲基化物中间体。该中间体与细胞内亲核试剂反应，生成荧光加合物，被捕获在细胞内，而不会影响目标酶的活性。同时，该探针在异种移植（PDX）小鼠体内可使癌症成像时间延长，并且实现癌症组织的固定和免疫染色。相关内容以“γ-Glutamyltranspeptidase (GGT)-Activatable Fluorescence Probe for Durable Tumor Imaging”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202013265）。
首先，作者选择了先前报道的罗丹明衍生物HMDiEtR（羟甲基二乙基罗丹明）作为核心荧光团，将γ-谷氨酰基部分作为酶底物，和HMDiEtR的氧杂蒽第4位氟甲基化后相连，设计了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu。酶催化的γ-谷氨酰基部分水解会释放出氟离子，从而产生氮杂醌甲基化物中间体（Figure 1a）。
（来源：Angew. Chem.Int. Ed.）
为了证实该探针设计的可行性，作者制备了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu和4-CH2OH-HMDiEtR，作为模型反应产物（Figure 1a），并评估了它们在水溶液中的光物理性质。作者测量了各种pH条件下反应产物的吸光度和荧光光谱，并绘制了最大值，以计算pKcycl值（Figure 1b）。结果4-CH2F-HMDiEtR-gGlu的pKcycl值为5.8，这表明4-CH2F-HMDiEtR-gGlu在pH 7.4的生理pH下将主要以无色的螺环形式存在。相比之下，4-CH2OH-HMDiEtR的pKcycl值为9.6，表明它在pH 7.4下主要以有色的荧光开放形式存在。此外，作者还证实了在体外与GGT反应后，4-CH2F-HMDiEtR-gGlu转化为4-CH2OH-HMDiEtR，并且该反应伴随可见光区域的吸收和荧光的恢复（Figure 1c, d）。
接着，作者评估了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu在细胞内的残留情况，并与先前报道的gGlu-HMRG相比较。作者将两种探针分别用于SHIN3细胞（高GGT活性），并在清洗以及与培养基孵育前后捕获荧光图像，然后用4％多聚甲醛（PFA）固定细胞（Figure 2a, b）。结果显示，与gGlu-HMRG相比，洗涤或固定后4-CH2F-HMDiEtR-gGlu的酶反应产物保留得更好。
（来源：Angew. Chem.Int. Ed.）
最后，作者将源自患者的肿瘤组织植入小鼠体内，研究了4-CH2F-HMDiEtR-gGlu在体内癌症成像中的适用性（Figure 3）。作者将探针皮内注射到患胰腺癌的PDX小鼠模型中，并使用IVIS荧光成像系统观察了活体小鼠中的荧光信号。由图可见，经gGlu-HMRG和4-CH2F-HMDiEtR-gGlu处理后，均可观察到荧光激活。但在前一种情况下，荧光产物迅速从肿瘤部位漏出，产生非特异性背景信号；而4-CH2F-HMDiEtR-gGlu表现出更持久的信号和较高的肿瘤与背景（T/B）信噪比（Figure 3a, b）。使用共聚焦显微镜观察活体小鼠的肿瘤组织，观察结果证实了gGlu-HMRG和4-CH2F-HMDiEtR-gGlu均表现为肿瘤特异性荧光信号，尽管前者的信号迅速降低（Figure 3c）。另外，为了探究所获得的荧光信号的稳定性，作者在注射后4小时切除肿瘤组织，并用0.2％ PFA固定，依次浸泡在15％蔗糖和30％蔗糖溶液中，冷冻并切片。用APC抗原HLA对切片进行免疫染色，以靶向人癌组织。结果发现，4-CH2F-HMDiEtR-gGlu获得的荧光信号被很好地保留，并与HLA免疫染色很好地共定位；而在gGlu-HMRG作用的情况下，由于该过程中的渗漏，未观察到荧光信号（Figure 3d）。
（来源：Angew. Chem.Int. Ed.）
总而言之，作者设计并合成了一种新型可激活的具有细胞内滞留性的GGT荧光探针4-CH2F-HMDiEtR-gGlu，其在与酶反应后显示出显著的荧光激活作用，并通过反应保留在靶细胞内，而不会影响靶酶活性。这对于评估肿瘤新药的功效和药代动力学具有重要的意义。