蛋白质之间的相互作用是细胞所有活动的核心。为了了解其过程，并在出错时进行有效的干预措施，研究人员需要工具来观察和监控蛋白质之间的相互作用。但在观察的过程中需要引入人工元素的系统，或是通过固定、标记等其他方式扰乱细胞的自然活动。下面介绍四家公司设计的四种不同的、观察蛋白质相互作用的方法。Navinci (原 Olink Biosciences) 是邻近连接技术 (PLA) 的先驱。现在，该公司有了一种新的检测系统，目的为了提高检测的灵敏度和特异性。该系统被称为 “纳维尼邻近连接平台”(Naveni Proximity Ligation Platform)，其可以检测相互作用的蛋白质，即使是在低水平，也不需要过度的人工表达。Navinci 的研发总监 Agata Zieba-Wicher 博士说:“我们的方法与典型的免疫染色方法的区别在于，我们一次应用两种抗体。”“它非常适合于检测相互作用的蛋白质，或蛋白质磷酸化以及蛋白质自己本身。”这个方法的第一步是，抗体与每一个感兴趣的蛋白质结合。接下来 “Navenibodies”（与第一抗体结合的抗体）与单链 DNA 寡聚体结合。这些寡聚体可以相互杂交，它们是提高系统特异性的关键。这些寡聚体单独形成发夹，每个发夹都能被不同的酶消化。当消化酶切开第一个发夹时，发夹的末端被释放出来，但新释放出来的片段仍然与附着在抗体上的部分杂交。当其他寡核苷酸被消化时，发夹被释放，产生一个单链片段，与第一个寡核苷酸的松散末端杂交。这就形成了一个圆。环状 DNA 被放大，再加入荧光标记的核苷酸进行检测。只有当两种蛋白质相互作用时，这些寡聚体才会形成环状，使 Navenibodies 之间的距离在 40nm 以内。在脱靶抗体结合的情况下，假阳性的风险很低。在 Navenibodies 中将抗体和寡聚物连接在一起也可以减少步骤的数量并增加检测的灵敏度。Zieba-Wicher 指出：“在前一步之上的每一步都会降低该方法的效率。”“现在，我们看到信号强度增加到原来 PLA 的 10 倍。”Naveni 平台可以检测癌细胞的早期转移。在 b-catenin 和 E-cadherin 之间形成的蛋白质复合物将相邻的细胞固定在一起。当它们停止相互作用，细胞失去联系时，迁移就开始了。当 b-catenin 和 E-cadherin 不再相互作用时，Navenibodies 显示的荧光变化对应于迁移的开始。因为转移是由这种相互作用的变化触发的，而不仅仅是蛋白质的表达水平，简单地标记它们是不够的。“这些蛋白质的表达并没有告诉我们一切，”Zieba-Wicher 解释道。“通过观察两种不同细胞上的两种不同蛋白质之间的相互作用，我们可以看到这种转变何时发生。”该方法还可以检测蛋白质磷酸化。当一种用于检测总蛋白的抗体和一种检测磷酸酪氨酸的抗体一起使用时，只有磷酸化的蛋白质会产生信号，因为这是两种抗体相互作用的地方。Zieba-Wicher 说:“不需要特定的抗体，就可以检测到特定的磷酸化。”“磷抗体的质量并不总是最好的。有很多交叉反应。但这种方法可以用于任何目标，只要存在针对总蛋白的抗体。”2012 年，Promega 推出了 NanoLuc，其从虾中提取 19 kd 荧光素酶，经过改造后，发光亮度比之前的荧光素酶高出 100 倍。它已经作为一个发光供体的生物发光共振能量转移 (BRET) 测定，以测量分子的接近。例如，Promega 使用 NanoLuc 创建了两种高灵敏度的检测蛋白质相互作用的方法，NanoBRET (NanoLuc BRET) 和 NanoBiT (NanoLuc Binary Technology)。在 NanoBRET 中，NanoLuc 融合到感兴趣的蛋白质上，相互作用的蛋白质融合到 HaloTag 上（一种带有红移荧光团的细菌酶)。当两个分子结合在一起时，能量从 NanoLuc 转移到 HaloTag 激活荧光团，产生信号。“BRET 与 FRET 非常相似，”Promega 应用专家 Erik Bonke 博士说。“不同之处在于，我们不是用两个荧光团，而是用一个荧光素酶作为供体。”在早期版本的 BRET1 中，供体和受体的波长有相当大的重叠，限制了检测的灵敏度。NanoBRET 的红移受体荧光团使供体和受体峰波长之间的分离增加了三倍。邦克解释说:“因此，进入受体通道的供体信号就会减少。”“这使我们能够大规模提高信号本底比，并提高检测灵敏度。”NanoBRET 的信号是可逆的，在动态相互作用的研究中工作得很好。“如果蛋白质再次分离，我们就失去了 BRET 信号，”Bonke 指出。“这项技术真的可以让你看到动态，因为此你可以测量其关联和分离。”在验证测试中，NanoBRET 成功检测到低于体内浓度的蛋白 FKBP 和 FKR 之间的相互作用。“我们实际上可以在内源性表达水平以下检测这两种蛋白的相互作用，”Bonke 断言。“NanoBRET 是一种非常强大和敏感的技术。”在另一个演示中，NanoBRET 量化了药物 IBET151 在 BRD4 和两种不同组蛋白之间相互作用的活性。Bonke 指出，与 HaloTag 的融合并不能阻止组蛋白正常地融入染色质。实验进行时，荧光数据显示，IBET151 对 BRD4 - 组蛋白 4 相互作用的破坏强于对 BRD4 - 组蛋白 3 相互作用的破坏。NanoBiT 使用分裂成大亚基和小亚基的 NanoLuc 版本。每个亚基与感兴趣的蛋白质融合，当蛋白质相互作用时，亚基连接形成一个功能的荧光素酶。对亚基的稳定性和低亲和力进行了优化。“溶液中的这两个亚基不会自发地互补，”Bonke 强调。“只有当他们聚在一起并通过其他方式进行身体接触时，他们才会相互补充。”NanoBiT 像 NanoBRET 一样，信号是可逆的，因为亚基可以被分离。“对于像分裂 GFP 这样的自体荧光蛋白来说，这是不可能的，”Bonke 建议道。“一旦这些片段组装起来，荧光团成熟意味着它们不会分离。有了 NanoBiT，你可以使用两种方式测量。”NanoBRET 需要专门的仪器来读取荧光信号，但 NanoBiT 与传统的光度计一起工作。虽然这对 NanoBiT 有利，但 NanoBRET 也存在有利地方。使用 NanoBiT 时，两个融合标签必须在物理上相互作用，而使用 NanoBRET 时，它们只需要彼此靠近即可。因此，根据正在研究的蛋白质相互作用，这些不同可能会决定哪种检测方法更可取。GTP Gi 结合试验检测 GPCR 的非放射性激活G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 是一个庞大而多样的跨膜蛋白家族，在众多信号通路中发挥着重要作用。PerkinElmer 最近推出了新的检测试剂盒，旨在促进 GPCRs 和 GPCR 抑制剂的治疗发现。其中一种新检测方法是 HTRF GTP Gi binding kit，这是业界首个基于 tr - fret 的 GTP 结合检测试剂盒。该试剂盒使用均匀时间分辨荧光 (HTRF)，将荧光共振能量转移技术 (FRET) 与时间分辨测量相结合，用于检测分子相互作用。HTRF 的一个关键特征是它在时间上非常稳定，允许在数小时或数天内重复测量。当配体与 GPCR 的细胞外表面结合时，信号级联始于 GTP 与 GDP 的交换。HTRF GTP Gi 结合检测试剂盒使用标记有荧光供体分子的 GTP 模拟物和标记有荧光受体的抗 Gi 抗体。GPCR 激活后，标记的 GTP 类似物与 G 蛋白结合，将供体和受体结合并产生荧光信号。信号强度与 GPCR 活性成正比，抑制激活的化合物会降低信号。PerkinElmer 生命科学技术平台试剂负责人 Mathis Laffenetre 说:“这是非常强大的，因为 GPCRs 参与了许多疾病相关的信号通路。”“在这种新的检测试剂盒中，例如，GTP 与 Gi 结合与疼痛途径有关，所以这样的研究可能有助于开发慢性疼痛的新疗法。”作为第一个用于 GTP 与 Gi 结合的 TR-FRET 检测方法，该试剂盒为研究 GTP 激活提供了一种有效的非放射性选择。“目前，监测 GTP 与 Gi 结合的唯一广泛使用的方法是基于放射性的方法，”Laffenetre 指出。“现在，没有接受过放射性训练或不希望使用放射性材料的科学家可以使用荧光技术研究 GTP 与 Gi 的结合。”GTP Gi 检测可以与 PerkinElmer 的其他 GPCR 试剂盒结合，以充分表征所研究的 GPCR。例如，cAMP Gi 试剂盒检测 cAMP 积累与 GPCR 激活的变化，以揭示第二信使的活性。信号的放大可以在整个级联过程中的许多点发生。Laffenetre 解释说，这就是为什么测量信号源和最终结果一样重要。他指出:“GTP 结合和 cAMP 分析是两个透镜，它们分别观察信号的来源和信号在细胞内传播时形成的河流，并从其他生物系统收集信息。”“因此，使用双 GTP 结合 /cAMP 系统可以更深入地了解信号，因为它解释了信号源和最终结果之间的差异。” 他补充说，如果下游扩增占最终信号的更大比例，那么阻断 GPCR 的候选药物可能就不那么有吸引力了。KRas 突变在癌症中很常见，但这种蛋白质长期以来被认为是 “不可用药” 的，因为它没有明确的结合囊可以被小分子靶向。然而，最近发现了新的结合囊，重新激发了人们寻找 KRas 潜在抑制剂的兴趣。今年，安进 (Amgen) 的 Lumakras 成为首个获得 FDA 批准的 KRas 抑制剂，其他药物也可能很快获得批准。但直接抑制 KRas 并不是唯一的选择，其正在探索替代方法包括抑制交换因子蛋白或抑制与效应蛋白的相互作用。反应生物学研究科学家 Ekaterina Kuznetsova 博士说:“我们已经生产了蛋白质，并验证了一套检测方法，用于发现针对 KRas 途径不同步骤的化合物。”KRas 依赖于包括 SOS1 和 SOS2 在内的效应蛋白，它们介导了 GDP 向 GTP 的转化。Reaction Bio 的一系列检测包括一种核苷酸交换检测，用于检测 SOS1/2 介导的荧光标记 GDP 与 GTP 的交换，以及蛋白 - 蛋白相互作用检测，以筛选阻止 KRas 与 SOS1 或 cRAF 蛋白相互作用的化合物。在核苷酸交换试验中，KRas 用荧光 GDP 分子标记。当 SOS1/2 用 GDP 交换未标记的 GTP 时，KRas 被激活，荧光水平降低。因此，测量荧光水平相当于测量 KRas 活化。该检测方法可用于筛选抑制 KRas 激活或各种 KRas 突变体的化合物。在抑制剂存在的情况下，荧光水平保持稳定，表明 GDP-GTP 交换没有发生，KRas 仍然 “关闭”。该分析还可以作为一种选择性工具，用于比较抑制化合物对不同 KRas 突变体的影响。Reaction Bio 也有基于 htrf 的检测蛋白 - 蛋白相互作用中断的方法。与 GDP 结合的 KRas 与 SOS1 成功结合会产生荧光信号，通过荧光信号的下降可以量化抑制剂的活性。cRAF 试验使用 GTP 结合的 KRas，但工作方式相同。“我们在野生型 KRas 和 G12 突变体中都观察到了这种相互作用的抑制，”Kuznetsova 说。Reaction Bio 也有一个生物物理分析，使用表面等离子体共振 (SPR) 来量化与 KRas 和 SOS1 的结合亲和性。野生型或突变型 KRas 被绑定到芯片上，化合物从芯片上流过。Kuznetsova 解释说：“当它与蛋白质相互作用时，测量是实时进行的，因此它能让你计算结合和分离的速率。”“基于这些速率，就有可能计算出结合亲和力。”“该技术并不局限于小分子结合，”Kuznetsova 继续说道。“也有可能研究肽结合和蛋白质之间的相互作用。” 将 SOS1 与芯片结合，流动的 KRas 加上抑制化合物 bay293，可以量化不同浓度化合物的结合抑制。一系列创新的工具和技术允许研究人员观察、描述和量化以前难以理解的蛋白质相互作用。随着这些工具产生新的实验和发现，更精确的靶向疗法肯定会随之而来。
https://www.genengnews.com/topics/drug-discovery/new-tools-illuminate-protein-protein-interactions/
编译丨张洁丽
