文献解读 | 对过度表达的环状RNA翻译的综合分析揭示了线性转录体的普遍翻译
论文：Comprehensive analysis of translation from overexpressed circular RNAs reveals pervasive translation from linear transcripts（对过度表达的环状RNA翻译的综合分析揭示了线性转录体的普遍翻译）
摘要
环状RNA(CircRNAs)是由下游5‘到上游3’剪接位点的反向剪接而产生的一类广泛而保守的RNA。CircRNAs是组织特异性的，与包括癌症在内的疾病有关。例如，它们可以用作微RNA(MiRNAs)或RNA结合蛋白(RBPs)的海绵。
此外，有些包含开放读取帧(ORF)，并可能被翻译。然而，这类肽的功能相关性在很大程度上仍未确定。在这里，我们报告了圆环ZNF 609的ORF在从过表达结构中表达时得到了有效的翻译。
然而，不能检测到内源性蛋白质。此外，圆周ZNF 609翻译的起始与m无关。6A生成酶METTL 3或RNA序列元件，如内部核糖体进入位点(IRESS)。
令人惊讶的是，一项全面的突变分析显示，缺失的结构，在生产周期ZNF 609，仍然产生观察到的蛋白质产品。这表明，表面环ZNF 609的翻译来源于过表达质粒的反式剪接副产物，并强调需要仔细评估圆环RNA过表达结构，特别是在进行功能研究时。
过表达CircZNF 609的表观翻译
CircZNF 609与其同源mRNA zf609共享起始密码子，并包含一个停止密码子，在循环时生成一个ORF，其中包含一个额外的氨基酸，该氨基酸不存在于从zf609 mrna翻译而来的全长蛋白中。
在本研究过程中，据报道，crcZNF 609与核糖体有关联，并可被翻译成。因此，我们使用CircZNF 609作为测试用例来研究底层机制。
我们使用了两种不同的圆环RNA过表达系统，允许在C端3×标志标记上进行帧内融合，通过westernblotting可以检测到这个标记。
Northernblotting证实RNase R处理的N2a细胞中存在内源性CircZNF 609，这是我们的过度表达实验的尺寸标准。将两种表达系统(I，II)的质粒转染HEK293T细胞，用Northern印迹法分析产物。
在这两种情况下，都检测到了许多潜在的线性转录本，但也检测到了环状RNAs。为了进一步证实圆环ZNF 609的循环性质，我们在不同的时间点用RNase R酶切过表达的RNA，观察到crcZNF 609在其他RNA产物被消化时保持稳定。
CircZNF 609肽不是从顺式-拼接副产品
圆环RNA的翻译也可能是由线状剪接副产物引起的，这往往没有得到充分的控制。因此，我们设计了一系列的实验来评估过表达的cZNF 609是否真的是从环状RNA中翻译出来的。我们首先探讨了顺式-拼接事件。
当含有圆环ZNF 609过表达盒的转染质粒被转录时，可以想象聚合酶可能偶而读取终止信号并产生一个滚动的循环RNA。这样的RNA将被封顶并包含过表达盒的多个拷贝。
由于存在5‘和3’剪接位点，这些rna可以进行剪接，并生成一个转录本，并以依赖帽的方式进行翻译。为了排除这种情况，我们使用不同的限制性内切酶将质粒切成两半，并转染线性dna，这不会导致滚动循环转录。
此外，DNA片段被去磷酸化，以防止发生潜在的再连接。正如预期的那样，CircZNF 609仍然是生成的，因为从线性化模板中仍然可以剪接crna表达盒。
一贯地，西方杂交标记清楚地表明，这两条蛋白带也是从含有圆环rna表达盒的质粒片段中产生的，排除了滚动循环转录和潜在的可能性。当选择去除圆环RNA盒启动子(K-X)启动子的消化策略作为阴性对照时，既未检测到圆环RNA，也未检测到相应的蛋白质。
CircZNF 609缺乏经典的IRES结构，各种augs被广泛使用
在与帽无关的翻译起始阶段，特定的IRES元素有助于将核糖体亚基定位到正确的起始密码子。为了寻找潜在的IRESS，我们研究了CircZNF 609的第一个8月(称为5‘UTR)上游的序列，因为这是IRES元素经常被定位的区域。序列被系统缩短，质粒被转染到HEK293T细胞。
转染的结构被平等地表达121个NTS 5‘UTR中89个NTS的缺失不会导致两条蛋白带(第3-6条)的减少。5‘UTR(DEL 121)的完全缺失导致从8月1日开始的高分子量蛋白质(蛋白A)的丢失。
第二个，下游8月，然而，仍然有效地使用(第7车道)，表明将停止密码子直接融合到第一个8月抑制启动，但5‘UTR并不包含一个特定的IRES元素。
我们接着推断，IRES可能在CDS中形成，因此系统地删除了CDS。所有删除结构，转染HEK293T细胞和RNA，用Northernblotting分析翻译的蛋白质。所有截短的结构都产生了预期大小的蛋白质，从第一次和第二次8月开始，因此，CDS中的IRES元素也不太可能出现。
值得注意的是，3‘端片段(Del-CDS 507-747)的缺失导致从8月1日开始只有一个肽。从8月2日产生的蛋白质给出了一个非常微弱的带。然而，这个序列是否真的会影响从8月2日开始，还需要进一步的研究。
讨论
由于内源性蛋白产物难以发现，目前尚不清楚crcZNF 609主要是非编码蛋白还是功能蛋白编码RNA。为了更好地揭示CircZNF 609的翻译机制，我们对大量的结构和条件进行了广泛的测试，并得出结论：我们过度表达的结构的翻译可以从不同的augs开始。
Crna过表达系统的一个主要关注点是线性转录本的生成以及顺式和反式在细胞生物学实验中很少被控制的剪接事件。因此，我们试图从我们的过度表达式构造中仔细地描述CircZNF 609的翻译。
通过限制酶切和将质粒整合到基因组中，我们发现crcZNF 609明显被翻译，因此不是由顺式-拼接滚动圆圈成绩单。另外，由于剪接位点的缺失会导致蛋白质产物的完全丢失，剪接在蛋白质合成过程中起着重要的作用。
然而，当一个alu元素被删除，crna剪接被完全取消时，蛋白质产物仍然很容易被检测到，这表明反式剪接事件导致被翻译成线性文本的事件。观测的分子基础反式剪接问题尚不清楚，需要进一步调查。
从线性副产品的翻译也得到了以下结论的证实：离体转录和转染的圆环RNA不会导致可检测的蛋白质产物。另一方面，也可以想象cRNA需要经过细胞生物发生才能获得有效翻译的许可。
综合起来，人们很容易推测crna过表达的结构可能会经历。反式-剪接，因此需要仔细评估这些工具。虽然还没有经过测试，但是类似的系统，例如使用其他的侧翼内含子，可能会导致类似的结果。反式-剪接效果，也应小心控制。
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