基于扩增子测序与GeoChip 5.0 联合分析的噬菌体与原核微生物群落研究
Bacteriophage-prokaryote dynamics and interaction within anaerobic digestion processes arcoss time and space
Junyu Zhang, Qun Gao, Qiuting Zhang, Tengxu Wang, Haowei Yue, Linwei Wu1, Jason Shi, Ziyan Qin,Jizhong Zhou, Jiane Zuo and Yunfeng Yang
杂志：Microbiome
发表时间：2017年5月
影响因子：8.4973
一、背景
噬菌体与原核生物的动态变化和相互作用被认为是影响微生物群落组成和生态系统功能的重要因素，但我们目前对噬菌体与原核生物群落组成的时空变化还知之甚少，这使得我们不能精确地了解他们角色和影响。厌氧沼气池由于容易获取，操作稳定，具有营养丰富的环境，含有大量的噬菌体和原核细胞，因此被认为是测定噬菌体与宿主相互作用的理想模式系统。
二、材料和方法
本文从不同地理分布选取了中国三个地方的污水处理厂的4个厌氧沼气池（中国北部的北京1个、中国中部的山东青岛1个、中国南部的浙江宁波2个，除宁波有一个厌氧沼气池的发酵温度为高温，其余均为常温），从2012年10月至2013年9月，每月进行一次采样。对采集的样品进行物理化学检测，包括Fe、Cu、Cr、SO42-、Cl-、NH4+-N和pH及过程性能指标TS、VS和COD；提取DNA，基于MiSeq平台进行16S rDNA V4区测序，并用包涵455种噬菌体探针的Geochip 5.0探测噬菌体基因。然后对获得的序列信息进行一系列的分析。
三、结果
1、噬菌体与原核微生物随着功能的时空变化而动态变化
共获得56143个原核微生物OTUs和来自78种噬菌体的183种噬菌体基因，其中91种噬菌体基因普遍存在于四个厌氧沼气池中，且其相对丰度是只在平均单个厌氧沼气池中出现的基因2.4倍，说明优势噬菌体在不同地点是普遍存在的。
单个噬菌体在时间尺度上的变化非常大，表明在激活污泥的过程中有大量的噬菌体产生和消亡，揭示了噬菌体在污泥环境中高度活跃。
图2 (A) 噬菌体丰度、 (B) 原核微生物丰度、 (C) 噬菌体α多样性、(D) 原核微生物α多样性的时空变化
注：BJ: Beijing samples; QD: Qingdao samples; Ningbo-M: samples from Ningbo anaerobic digester maintained at mesophilic temperature, and Ningbo-T: samples from Ningbo anaerobic digester maintained at thermophilic temperature.
2、噬菌体对原核微生物群落自上而下的控制
对原核微生物OTUs跟噬菌体的丰度进行分析，图3（a）中可以看到原核微生物跟噬菌体的丰度之间的相关性虽然不是非常强，但噬菌体的丰度是随着原核微生物的丰度增大而增大。（b）、（c）分别是原核微生物OTUs跟噬菌体间α多样性和β多样性的相关分析，发现两者间的β多样性相关性非常强。
另外通过多元回归矩阵分析，发现噬菌体作为一种生物影响因子，对原核微生物群落组成的影响高达40.6%。说明噬菌体对塑造细菌群落结构起着非常重要的作用。
图3 噬菌体与原核微生物(a)丰度、(b)α多样性、(c)β多样性的斯皮尔曼相关分析（相关性由P<0.050决定）
表1 非生物因素与生物因素对原核微生物群落组成影响的多元回归矩阵分析结果
3、噬菌体对过程性能的影响
通过最小二乘法模型分析噬菌体、原核微生物和过程参数之间的关系，发现噬菌体对生物气体的生成、挥发性固体含量影响很大，虽然原核微生物对这些过程参数的变化也有重要的影响，但没有噬菌体的影响显著。
注：箭头上的数字是最小二乘模型的相关系数R2，***P<0.001，**P<0.010，*P<0.050
为将噬菌体、微生物群落和厌氧消化的过程性能联系起来，进行了通路分析。从图5中可以看到有4条重要的通路。
图5 将噬菌体和微生物群落与厌氧沼气池关联起来的生物化学通路分析
注：微生物群落用紫色表示，中间代谢产物用绿色表示，甲烷和挥发性固体用红色表示，通路用箭头表示
第一条通路是噬菌体侵染宿主的通路。长尾噬菌体、肌尾噬菌体、短尾噬菌体这三种噬菌体主要侵染的是广古菌门的古菌，在本次的样品中所有的广古菌门微生物都是产甲烷古菌。长尾噬菌体、肌尾噬菌体、短尾噬菌体这三种噬菌体的密度跟广古菌门微生物平均丰度的相关性很强（图6），这就说明噬菌体对甲烷的产生具有很大的影响。
第二条通路中噬菌体裂解细菌，会增加厌氧发酵过程中有机物的量，这对初级生产具有正反馈的作用。
第三条通路显示厌氧反应池中原有的或细菌裂解产生的有机物通过厌氧发酵转化成乙酸盐，然后被甲烷化产生甲烷。
第四条通路显示的是未被微生物分解的有机物从厌氧发酵池流出后变成挥发性固体。
图6 古菌噬菌体基因平均信号密度与广古菌门平均丰度相关性图（N=46）
4、噬菌体与原核微生物间的网络分析
图7 噬菌体和原核微生物OTUs组成的关系网络
注：网络连接的正相关与负相关是由两个节点之间的斯皮尔曼相关性的正负决定的，正相关用红色表示，负相关用蓝色表示，连线的宽度代表斯皮尔曼相关系数的大小
基于斯皮尔曼相关性构建噬菌体与原核微生物之间复杂的关系网络，虽然原核微生物有55个OTUs超过了噬菌体基因数，但这也表明两者之间的相互作用强而稳定。
从图中可以看到一半的连接都是细菌之间的，占了50.7%，噬菌体与细菌之间的连接只有30.7%，噬菌体之间的连接占18.6%。
其中有好几个肠杆菌噬菌体在网络中作为重要的节点，连接很多变形杆菌，所连接的细菌大多属于丛毛单胞菌科、红环菌科、红杆菌科而非肠杆菌科。这可能说明这些细菌是共居的，或者说这些肠杆菌噬菌体可侵染的宿主很多。除13a之外，肠杆菌噬菌体跟细菌之间的连接都是正相关的，而只有Aeromonas phage phiO18P, Aeromonas phage Aeh1,and Mycobacterium phage Che12则跟细菌之间呈现负相关的连接。基本上所有噬菌体-噬菌体之间的连接都是正相关的，意味着共侵染和共居的可能性。
四、小结
通过先进的高通量技术，对中国4个污水处理厂厌氧沼气池的噬菌体和原核微生物群落组成进行检测，虽然生物气体的产生在整个过程相对稳定，但噬菌体和原核微生物群落在整个研究过程中呈现月度性波动，表明两者间的α和β多样性存在非常重要的相关性。其中非常突出的是噬菌体对原核微生物群落组成变化的解释度达到40.6%，远高于非生物因素的14.5%。结果表明，噬菌体与过程性能包括生物气体产量和挥发性固体的浓度有非常重要的联系。
五、结论
噬菌体是控制原核微生物组成和过程性能的主要生物因子。因此，噬菌体在塑造原核生物群落动力学和厌氧消化的过程性能方面可能发挥更大的作用。
六、文章亮点
以厌氧沼气池为模型，基于 16S rDNA 扩增子测序结合GeoChip 5.0 芯片技术探索噬菌体与原核微生物在厌氧消化过程中时间和空间的动态变化和互作， 并通过网络图分析，揭示两者关联，数据挖掘充分，分析讨论有理有据。