Circulation Research｜靶向线粒体炎症通路的β-OHB可改善心力衰竭
心力衰竭(HF)是世界范围内导致发病率和死亡率的主要原因。流行病学研究表明，超过50%的HF患者属于射血分数保留型心衰（HFpEF），而非射血分数减少型心衰 (HFrEF)。目前，治疗HFrEF的方法均未对HFpEF显示出疗效，且仍然缺乏针对HFpEF的药物。此外，发展HFpEF治疗药物的面临的主要问题是缺乏涵盖HFpEF复杂性的动物模型，因为HFrEF近来普遍被认为是全身疾病的最终表现。高血压、糖尿病、肥胖和衰老等多种并存疾病已被证实会增加HFpEF的风险。
通过3-Hit策略构建的HFpEF模型
HFpEF的风险随着年龄的增长而急剧增加，特别是在综合了高血压、肥胖和血管疾病这些危险因素的模型中，作者用高脂饮食(HFD)喂养3个月大的小鼠13个月，并在最后一个月腹腔注射一团脱氧皮质酮(DOCP；75 mg/kg)，以加重高血压和全身炎症，称之为“3-Hit”策略(Figure 1A)。3个月内高脂饮食导致肥胖和糖耐量受损。13个月后，与6个月大(对照组)或16个月大(老龄)小鼠相比，接受3-Hit治疗的小鼠出现病理性心肌肥厚和高血压，并伴有内皮依赖性血管松弛受损，氧化应激和炎症增加(Figure 1B-1E；Figure 1D -1H)。这些小鼠在一般运动能力上没有表现出差异，但3-Hit的小鼠在跑步机上的跑步时间显著减少，这表明3-Hit治疗导致了运动不耐受(Figure 1F；Online Figure II)。组织病理学数据显示，3-Hit暴露的心脏含有明显的胶原沉积和间质纤维化(Figure 1G和1H)。胶原合成和促纤维化信号通路的基因表达上调，包括I型胶原α2链(COL1α2)、纤维连接蛋白(Fn1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)(Figure 1I)。此外，肺湿重归一化为胫骨长度(LW/TL)，作为肺水肿的评估，在3-Hit处理的小鼠中也增加(Figure 1J)。Millar尖端电导导管的左心室(LV)压力-容积(P-V)环显示，3-Hit小鼠的舒张期松弛(-dp/dt)受损，舒张末容积(EDV)和每搏输出量(SV)减少，反映了HFpEF的舒张期功能障碍的特征(Figure 1K-1N)。重要的是，与对照组和老龄小鼠相比，3-Hit没有改变左心室射血分数(EF)，但降低了心输出量(CO)，这与左心室血液回流减少一致(Figure 10；Online Figure IJ-IL)。综上所述，3-Hit处理的小鼠概括了HFpEF的典型病理表型。
Figure 1 通过3-Hit策略构建的HFpEF模型
线粒体过乙酰化导致3-Hit心脏中NLRP3组装过度
最近的证据表明，亚硝酸盐胁迫驱动的系统性炎症在HFpEF的病理生理过程中起着至关重要的作用。在作者的模型中，3-Hit的小鼠心脏中，caspase-1的裂解和下游促炎症白细胞介素(IL)-1β和IL-18的分泌增加(Figure 2A)。在HFpEF患者的血液样本中还观察到IL-1β和IL-18水平高于相应年龄的非心力衰竭患者，这表明在HFpEF发病过程中NLRP3介导的炎症级联反应被激活(Figure 2B-2E)。NLRP3炎症小体由感受器(NOD样受体蛋白3，NLRP3)、适配器(凋亡相关的带有caspase募集结构域的SPECK样蛋白，ASC)和效应器(Caspase1)组成。激活整个NLRP3依赖的炎症小体需要ASC的最佳空间排列。作者发现，在3-Hit的心脏中，ASC的丰度上调(Figure 2F)，有趣的是，大量ASC定位于线粒体(Figure 2G)。作者推测线粒体定位的ASC促进了炎性小体的组装。通过原位邻近结扎实验，作者在3-Hit心脏观察到了更多的NLRP3-ASC空间近似信号(Figure 2H和2I)。此外，作者从左心室组织裂解物的线粒体和细胞质组分中免疫沉淀ASC，发现线粒体定位的ASC与更多的NLRP3相关(Figure 2J)。当作者免疫沉淀NLRP3蛋白并用抗ASC抗体探针检测时，在线粒体部分观察到更强的ASC信号。这些数据表明，在3-Hit心脏中，线粒体定位的ASC在NLRP3炎症小体的形成中起作用。
Figure 2 3-Hit心脏内NLRP3炎症小体组装过度
进一步的研究表明，在3-Hit的心脏中，线粒体脱乙酰酶Sirtuin 3(SIRT3)的表达减少，线粒体蛋白乙酰化水平升高(Figure 3A)。对3-Hit心脏的乙酰组分析显示，277个蛋白乙酰化增强，80%的高乙酰化蛋白质位于线粒体中(Figure 3B和3C)。高乙酰化促进ASC线粒体定位。H9C2心肌细胞与SIRT3抑制剂3-TYP共孵育可促进蛋白质乙酰化和增加线粒体ASC的数量，而Sirtuin辅因子NAD+的前体烟酰胺单核苷酸(NMN)可减少蛋白质乙酰化和线粒体ASC，高乙酰化推动ASC在线粒体上定位 (Figure 3D)。此外，ASC线粒体定位的增加加强了ASC-NLRP3在培养细胞和3-Hit心脏中的相互作用(Figure 3E和3F)。作为炎性小体激活的结果，线粒体上形成的ASC斑点也被3-TYP升高，而被NMN减少(Figure 3G)。总之，这些数据表明，定位于线粒体的ASC促进了NLRP3炎症体的形成，而3-Hit心脏中的蛋白质超乙酰化而上调NLRP3炎症体的形成。
Figure 3 在3-Hit心脏中线粒体过乙酰化导致NLRP3组装过度
3-HIT诱导的HFpEF表型对线粒体蛋白乙酰化敏感
为了确定线粒体蛋白乙酰化是否在HFpEF的病理生理学中起作用，对SIRT3基因敲除(KO)小鼠进行了3-Hit的诱导。正如预期的那样，SIRT3 (KO)加剧了3-Hit诱导的心肌线粒体超乙酰化(Figure 4A)。线粒体蛋白乙酰化程度与心脏组织IL-1、β和IL-18水平呈正相关(Figure 4B和4C)。从表型上看，3-Hit的SIRT3 KO小鼠除了体重和糖耐受增加外，还出现了更严重的心肌肥厚、高血压、心肌纤维化、肺水肿和运动耐量(Figure 4D)。此外，P-V环分析显示KO+ 3-HIT保留了LVEF，但与WT+3-HIT相比，舒张功能进一步下降(Figure 4E至4H)。这些数据表明，3-Hit诱导的HFpEF表型对线粒体蛋白乙酰化敏感；高乙酰化伴随着更严重的病理表型。
Figure 4 3-Hit诱导的HFpEF对线粒体蛋白乙酰化敏感
β-OHB水平升高可逆转NLRP3诱导的线粒体功能障碍和纤维化
HFpEF患者血液中β-OHB水平较低，作者发现3-Hit治疗可增加血液中β-OHB的水平(Figure 5A和5B)。为了了解这是否是一种代偿反应并确定其分子基础，作者研究了3-Hit心脏中酮体的分解代谢。 C13 NMR分析显示，与对照组(Figure 5C和5D)相比，3-Hit心脏β-OHB氧化水平降低了约50%，并且禁食24小时后，3-Hit心脏组织中的β-OHB水平更高(Figure 5E)。在线粒体中β-羟丁酸脱氢酶1(BDH1)下调，该酶是催化β-OHB分解代谢第一步的酶；而其他与酮代谢相关的酶，如琥珀酰辅酶A：3-酮酸辅酶A转移酶(SCOT)和乙酰辅酶A乙酰基转移酶1(ACAT1)的蛋白丰度在3-Hit心脏中保持不变（Figure 5F through 5H）。证据表明，心脏中的β-OHBB氧化被3-Hit下调。相反，SIRT3 KO显著增加心脏β-OHB的氧化和BDH1的表达，而降低血液和心脏组织中β-OHB的水平。然而，KO组小鼠的HFpEF表型恶化，表明增加的心脏酮氧化可能不利于HFpEF心脏。
为了说明β-OHB在3-Hit心脏中的生物学功能，作者首先用异丙肾上腺素（ISO）和NLRP3炎性体富集巨噬细胞（MCM）的介质条件处理心肌细胞（H9C2），模拟3-Hit诱导的病理环境，然后添加β-OHB到培养液中。ISO和MCM共同刺激的H9C2细胞，线粒体呼吸作用受到抑制，并且呼吸旁路弱。但是β-OHB在生理浓度(0.50 mM)或药物浓度(5 MM)下均能改善H9C2细胞这种情况(Figure 5J)。重要的是，通过BDH1在H9C2细胞中过表达(OE)增加β-OHB氧化抵消了这种改善作用，而BDH1的敲除(KD)则增强了这种功效(Figure 5K和5L)。值得注意的是，在患有BDH1KD的细胞中加入0.5 mM的β-OHB，和在WT细胞中加入5 mM的β-OHB能达到一样的效果，这表明β-OHB通过一种非氧化机制保存了线粒体的功能(Figure 5J到5L)。
为了测试β-OHB是否能减轻炎症细胞因子诱导的纤维化，将3T3成纤维细胞暴露于含有和不含β-OHB的MCM中(Figure 5M)。细胞外基质基因Col1α1、Col1α2和Col3α1在MCM存在时表达增加，β-OHB可抑制这一表达，表明β-OHB阻断了炎性细胞因子触发的促纤维化信号转导(Figure 5N)。抗体介导IL-10中和，可独立于NLRP3炎症体参与心肌纤维化，但并不能消除MCM对纤维化基因表达的影响，因此支持NLRP3炎症体在促纤维化机制中的相对特异性(Figure 5O)。综上所述，这些数据表明，3-Hit通过NLRP3炎症体依赖细胞因子的产生，损害了线粒体功能，激活了组织纤维化。β-OHB可抵消这种病理机制。
Figure 5 β-OHB水平升高抑制NLRP3诱导的线粒体功能障碍和纤维化
提高β-OHB水平改善小鼠高乙酰化和HFpEF表型
为了检验增加β-OHB的供给是否会改变小鼠体内的HFpEF表型，作者用酮酯(1 mg/g体重/天)或葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2 i)依帕列净(EMPA，10μg/g体重/天)治疗小鼠30天。酮酯灌胃后引起循环β-OHB浓度迅速升高(30分钟内)，而EMPA产生相对温和的升高，在给药后约3小时达到峰值(Figure 6A)。用曲线下面积(AUCS)估计，与对照组相比，在灌胃后的6小时内，酮酯组和EMPA组小鼠的β-OHB丰度分别增加了142%和59%(Figure 6B)。
作者用酮酯或EMPA治疗30天后，WT和KO组小鼠的心肌中β-OHB水平显著升高，KO+3-Hit小鼠心肌BDH1表达和β-OHB氧化水平显著降低(Figure 6C)。这两种处理都降低了WT和KO心脏的线粒体蛋白乙酰化，表明β-OHB可以独立于SIRT3调节蛋白质乙酰化(Figure 6D)。治疗还导致ASC-NLRP3相互作用减少，同时caspase-1裂解和NLRP3炎症小体介导的细胞因子分泌下调(Figure 6E至6H)。可以看到治疗并没有减少肥胖，但改善了高血压，降低了心脏脑钠素(BNP)mRNA水平，减少了间质纤维化，减轻了肺水肿，改善了运动能力，并减轻了心脏僵硬(Figure 6I至6K)。此外，利用分离的心肌线粒体，作者发现由谷氨酸/苹果酸(复合体I)或琥珀酸(复合体II)支持的ADP刺激的呼吸被3-Hit显著减少，经酮酯或EMPA治疗后显著改善((Figure 6L)。经过以上的验证，作者发现用酮酯或EMPA都取得了相似的有益效果，对WT和KO小鼠的改善程度也相似。综上所述，这些观察结果表明，提高β-OHB水平可以改善小鼠的高乙酰化程度，抑制NLRP3炎症体的形成，并改善HFpEF表型。
Figure 6 β-OHB水平升高可改善小鼠过乙酰化和HFpEF
β-OHB可减弱蛋白质的超乙酰化
作者发现，在3-Hit小鼠的心脏中进行酮酯处理，或者在培养细胞中加入β-OHB，柠檬酸合成酶（CS）的活性显著增加(Figure 7A)。为了确定β-OHB是否通过直接激活CS而减少乙酰辅酶A，作者将提纯的猪CS酶与浓度增加的β-OHB在37℃孵育10min。作者发现，CS被β-OHB激活呈剂量依赖性，而另一种主要的酮体AcAc只能在很高的浓度下激活CS(Figure 7B)。作者推测这种激活是由于β-OHB介导的赖氨酸β-羟丁酰化反应(Kbhb)所致。通过免疫沉淀分析证实，β-OHB暴露后H9C2细胞的CS-Kbhb水平升高。为了探讨这种激活是由整体修饰还是通过位点特异性修饰介导的，作者对CS催化区的6个赖氨酸残基进行了突变，发现赖氨酸395(K395)突变为精氨酸(K395R)，阻止了修饰，取消了β-OHB诱导的CS激活。另一方面，谷氨酰胺(K395Q)的突变模仿了修饰，导致CS在没有β-OHB的情况下激活，并消除了β-OHB的进一步激活(Figure 7C)。这些发现进一步提示了β-OHB通过Kbhb修饰K395激活CS。
有趣的是，发现β-OHB只有在细胞培养中有脂肪酸存在时才能降低细胞乙酰辅酶A水平，这种作用在BDH1KD下保持不变，但被BDH1OE部分消除，这表明β-OHB的作用不是由于它的分解代谢，而是通过调节脂肪酸分解代谢。利用13C示踪和乙酰组分析相结合的方法，作者观察到，在3-Hit的心脏中，脂肪酸衍生的13C同位素在乙酰化肽上的掺入量更高，这一比例在酮酯补充剂作用下下调(Figure 7D)。此外，H9C2细胞与棕榈酸(PA)孵育后，蛋白质乙酰化水平显著升高，β-OHB呈剂量依赖性的抑制H9C2细胞的蛋白质乙酰化水平。SIRT3-KD不能消除β-OHB的抑制作用，这与作者发现β-OHB的作用不依赖于SIRT3是一致的，提示β-OHB减少蛋白质乙酰化与改变脂肪酸利用有关。
接下来，作者使用荧光脂肪酸类似物Bodipy-FA评估脂肪酸摄取。作者观察到，β-OHB暴露24小时后，H9C2细胞的脂肪酸进入显著减少，这种抑制作用在ISO/MCM刺激的病理条件下保持不变(Figure 7E)。此外，β-OHB还降低了与脂肪酸摄取有关的基因的表达，这种作用被BDH1OE取消，而被BDH1KD增强(Figure 7)。而在3-Hit的心脏中，这些基因也被酮酯显著抑制，这表明β-OHB在生理和病理条件下都在转录水平上抑制脂肪酸的摄取(Figure 7F)。与脂肪酸摄取相比，在酮酯或β-OHB处理下，仅观察到β-氧化基因表达的轻微变化(Figure 7F)。综上所述，这些结果表明，β-OHB通过直接激活CS和抑制脂肪酸摄取，降低了乙酰辅酶A水平，从而减少了蛋白质乙酰化，保护了心脏免受炎症、纤维化和线粒体功能障碍的影响。
综上所述，作者建立了一种具有HFpEF临床特点的小鼠模型。此外，作者还发现线粒体高乙酰化和炎症的相互作用是HFpEF发病的主要原因，通过在体外和体内提高β-OHB的量可以改善HFpEF的发生。