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Adipose depot gene expression and intelectin-1 in the metabolic response to cancer and cachexia

贮脂基因表达和intelectin-1在癌症和恶病质代谢反应中的作用

一. 文章背景

恶病质(Cachexia)是一种与包括肿瘤在内的，多种慢性疾病相关的复杂的代谢综合征，以肌肉尤其是骨骼肌和脂肪组织的丢失为特征。患者骨骼肌的丢失一直是诊断的关键因素，近年来也有研究表明脂肪组织的丢失也在肿瘤恶病质中起重要作用，抑制贮脂细胞中脂解途径的发生可以抑制肿瘤恶病质(Cancer cachexia，CC)中肌肉的减少，而CC中调控脂解的因素还未知。在对在小鼠的CC研究过程中发现，内脏脂肪组织(Visceral Adipose Tissue，VAT)与皮下脂肪组织(Subcutaneous Adipose Tissue，SAT)相比丢失速度更快。这暗示在CC的过程中，脂肪细胞可能通过"fat-muscle crosstalk"导致了肌肉的丢失。然而此领域中对人的研究还尚少。作者希望通过对CC患者以及无恶病质的肿瘤患者(weight stable cancer，CWS)的VAT和SAT基因表达谱分析，探究引起CC的分子机制以及治疗方法。

二. 文章思路

三. 结果解析

1. 对样本分组，用基因芯片技术获取基因表达谱

实验的样本分为三组，分别为对照组，CC组以及CWS组，每组各8个样本。其中CC组(已鉴定)和CWS组的样本都为要进行切除手术的胃肠癌患者(包括食管癌，胃癌和胰腺癌)。对照组的样本为要进行肾切除手术的健康人。表1是各组样本的人体测量信息，可以看到CC患者有显著的体重丢失；与对照组相比，CC组和CWS组患者年龄显著偏大

表1. 各组样本的人体测量信息

取各组样本的SAT和VAT用Clariom S GeneChip 芯片检测基因表达量，所有样本的基因芯片数据按SCAN-UPC包的步骤进行过滤，共有8679(约站49%)的探针由于表达量过低或无被过滤。图1. A-B分别是在经过SCAN-UPC处理前后的样本PCA分析图，可以看到样本在处理前混在一起(A)；经过滤后CC和CWS组的VAT(红，黄三角)与自己的SAT以及对照组区分开了，说明有差异的存在，要进行下游分析

图1. 经UPC处理前后的样本PAC分析图

2. 在组内和组间展开差异分析

作者用limma包对组内的VAT VS SAT，组间的VAT，组间的SAT进行差异分析，DEG(差异表达基因)的筛选标准是FDR<0.05。结果如表2，可以看到在各组内，VAT和SAT间基因表达差异都非常之大，其中CC组内的DEGs最多(n=2101)；在各组间VAT的比较中，CC和CWS组间并没有显著的DEGs

表2. 各组内以及组间差异分析的结果

作者发现在VAT的组间比较中，ITLN1(Intelectin-1)是CC和CWS组与对照组比较当中表达量上调倍数最大的基因，分别是10倍和9倍(图2，红色)。而其在SAT的组间比较中差异并不显著。以上结果说明SAT对肿瘤或CC的敏感度不高，各基因表达量稳定；而VAT对肿瘤或CC敏感，很多基因表达量会受影响

图2. ITLN1在各组的VAT和SAT中的表达量

3. 基因富集分析

作者利用的MSigDB中的hallmark和curated基因集对组内VAT-SAT比较组和组间的VAT比较组进行GSEA分析，结果如表2所示(只展示了都显著富集的一些基因集)

作者首先分析了每组中不同脂肪组织之间的差异：

  • 在组内的VAT-SAT比较组中，脂肪生成和脂肪酸代谢基因集在CC和CWS组的SAT中显著富集，而相同基因集却在对照组的VAT中显著富集

  • 在组内的VAT-SAT比较组中，炎症反应基因集在CC和对照组的VAT中显著富集(图3)，但是对富集得分贡献最大的基因不同(图3紫框中)；CWS组中炎症反应基因的表达模式与CC相似，但是在VAT中的富集并不显著

  • 结论：不论肿瘤患者是否有恶病质，在VAT中脂肪组织生长相关的基因下调，同时炎症反应相关基因在VAT中表达上调

接下来作者分析了组间VAT的差异：

  • 在CC和CWS组的VAT与对照组VAT的比较中，脂肪形成和异物代谢相关基因集表达量显著降低

  • 在CC与对照组AVT的比较中，氧化磷酸化基因集在CC组VAT中表达量显著降低

  • 因为在肿瘤病人的VAT中，能量代谢相关基因表达下调，所以作者又针对棕色脂肪组织分化相关基因(GO:0045444)，对组间比较的各组进行了GO分析，发现在CC和CWS组与对照组VAT的比较中，表达量下调的基因中富集棕色脂肪组织分化相关基因

表3. 组内和组间的GSEA分析结果

图3. 炎症反应基因集在各样本中的表达量热图

小结：在肿瘤患者的VAT中，与脂肪生成以及能量产生/利用相关的基因表达量下调，这种特征在CC患者中更明显

4. qRT-PCR验证候选分子

作者用qRT-PCR实验来检测包括微阵列候选分子(ALOX15，ITLN1，PPAR2A)，脂肪褐变相关基(PPARGC1A，PRDM16，UCP1)，炎症相关基因(ACVR2A1，IL18，IL8)以及脂肪生成相关基因(LEPR，PDCD4，STAT5A)在内的共12各基因的表达量。

图4. qRT-PCR实验结果

5. ELISA法检测VAT和血浆中ITLN1的表达量

作者用ELISA法检测了三组中所有样本VAT中ITLN1的含量(图5)，发现只有CC组与对照组比，VAT中ITLN1表达量显著上升(p=0.014)

图5. ELISA法检测各组VAT中ITLN1含量

考虑到ITLN1在CC样本的VAT中高表达，作者想检测样本循环系统中的ITLN1含量是否上升。作者在原有各组样本的基础上，又在各组添加了12个样本，取样本血浆后进行ELISA实验检测ITLN1的含量(图6，右上角的图浓度单位经log10转换)。只有CC组和CWS组样本的比较中，ILTN1在样本血浆中的含量显著提高(p=0.02)

图6. ELISA法检测各组样本血浆中ITLN1的含量

今天的文献分享就到这里了，让我们快速回顾一下。作者为研究CC发生的分子机制，先是用基因芯片技术获取了CC，WCS以及对照组VAT和SAT的基因表达谱，用SCAN-UPC包过滤低质量探针。用limma包进行了组内VAT-SAT以及组间VAT，SAT的差异分析，得到了ITLN1等候选分子；随后针对各组进行了GSEA分析。之后用qRT-PCR实验检测芯片候选分子，炎症分子，脂肪褐变以及脂肪生成共12个基因在样本VAT中的表达量；ELISA实验检测了ITLN1在各样本VAT以及血浆中的含量。本文亮点是有自己CC以及CWS队列的芯片数据，数据在GSE131835中，由于文章3月末发表，数据要到5月末才开放。

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