慢病毒载体构建技术原理

　慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

　　慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂（图1）。

　　图1 慢病毒包装和侵染细胞的过程

　　慢病毒载体具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等特点。能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞。

　　慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达，因而可构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。使用慢病毒载体改造T细胞可用于CAR-T细胞治疗，CRISPR/Cas9文库构建使用的也是慢病毒载体。

慢病毒包装与纯化

　　慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装，收集细胞培养上清，通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。

慢病毒滴度检测

　　检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数

　　实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组

慢病毒载体优势

① 表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选，常用于构建稳转株。
② 安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。
③ 免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。