科研 |NAT COMMUN：NARS1的缺失损害皮质脑类器官的祖细胞增殖，导致小头畸形
编译：逍遥君，编辑：景行、江舜尧。
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天冬酰胺酰-tRNA合成酶1（NARS1）是蛋白质翻译所需的tRNA合成酶广泛表达的细胞质Ⅱa类家族成员。本研究对来自三个无亲缘关系的小头畸形和神经发育迟缓家系的7例患者中NARS1进行了检测。患者细胞显示NARS1蛋白减少、NARS1活性受损和整体蛋白合成受损。皮质脑类器官模型显示放射状胶质细胞（RGCs）增殖减少，导致小头畸形特征性的类器官变小。单细胞测序分析显示星形胶质细胞和RGC谱系的成分均发生改变，表明RGC增殖需要NARS1。该发现证明NARS1是满足蛋白质合成需求和支持人脑发育中RGC增殖所必需的。
论文ID
原名：Loss of NARS1 impairs progenitor proliferation in cortical brain organoids and leads to microcephaly
译名：NARS1的缺失损害皮质脑类器官的祖细胞增殖，导致小头畸形
期刊：Nature Communications
IF：12.121
发表时间：2020年8月
通讯作者：Gleeson, JG
通讯作者单位：加利福尼亚大学&拉迪儿童医院&加州大学
DOI号：10.1016/j.ccell.2020.06.004
实验设计
本文使用全外显子测序检测小头畸形患者NARS1基因的变异，并使用Sanger测序法和WB实验进行分子和蛋白水平的验证。此外，使用患者和正常人的细胞进行体外模拟小头畸形表型，利用单细胞测序技术进行验证和分析NARS1基因缺失对皮质脑类器官祖细胞增值的影响，并阐述机理。
结果
使用全外显子测序（WES）检测5000多名神经发育障碍个体中的遗传变异。其中，来自3个不相关家族的7例患者在NARS1中可能存在损伤性双等位基因变异（图1a）。所有患者均表现为小头畸形、智力残疾和神经功能进行性丧失。MIC-1433-III-3中患者的脑部MRI显示出重度小头畸形、弥漫性脑和小脑萎缩伴灰质和白质体积损失以及脑室扩大（图1b）。MIC-91-III-1和MIC-2116-III-1患者的MRI显示出轻度皮质和小脑萎缩以及侧脑室扩大（图1c，d）。由此可以推断，NARS1的双等位基因缺失导致了皮质体积的进行性丢失，与神经退行性临床过程一致。通过Sanger测序进行验证（图1e）。所有突变均在NARS1编码区内（图1f）。两个突变位于UNE-N结构域中，该结构域包括作为特异性ARS酶的“附加结构域”的一部分（图1g，h）；而另外两个位于催化结构域中（图1g-j）。脊椎动物的NARS1序列比对显示，患者中突变的残基在所有哺乳动物和大多数脊椎动物中是保守的（图1k）。
总之，这些结果提示NARS1双等位基因突变是这些个体的致病因素。
图1.小头畸形家系中NARS1突变的鉴定。（a）MIC-1433、MIC-2116和MIC-91系谱图。（b-d）患者脑部MRI图。（e）突变的色谱图。（f）NARS1基因组。（g-k）NARS1结构域及细节。
2 患者来源的细胞表现出NARS蛋白功能的丧失
为了确定突变对NARS1蛋白的影响，裂解患者来源的成纤维细胞并使用Western印迹检测，分析显示患者细胞中NARS1水平显著降低（图2a，b）。两种错义变体均使NARS1不稳定（图2c）。利用稳定同位素脉冲标记显示两种患者成纤维细胞细胞质中的NARS1 tRNA的活性均降低了约一半（图2d）。作为对照，额外评估了另外三种ARS（RARS、KARS和TARS）的活性：发现患者细胞具有正常活性（图2e）。结果表明，大脑中表达的NARS1，其错义突变影响蛋白稳定性，患者细胞的NARS1蛋白水平和活性均显著降低。
NARS1被认为是每个细胞中产生带电的细胞质天冬酰胺tRNA的唯一原因。嘌呤霉素作为模拟tRNA掺入到新合成的蛋白质中，以标记细胞来评估整体蛋白质合成。在来自健康父母的细胞中，发现了高丰度的标记，但来自两个家族的一个患者的细胞系显示标记显著减少（图2f），表明总蛋白合成减少。
图2.患者细胞显示NARS1功能丧失。（a）与肌动蛋白对照相比，来自两个未受影响（U1和U2）和两个受影响（A1和A2）的成纤维细胞水平降低。（b）WB定量结果。（c）在HEK293T细胞中cDNA表达患者突变的过表达。（d）患者成纤维细胞中NARS1 tRNA合成酶活性。（e）NARS1突变细胞中其他tRNA-ARS活性。（f）患者IPSCs在1h脉冲后显示嘌呤霉素掺入减少，表明蛋白质合成减少。TARS：苏氨酰-tRNA合成酶；KARS：赖氨酰-tRNA合成酶；RARS：精氨酸-tRNA合成酶。
3 NARS1影响皮质脑类器官的生成
为了模拟小头畸形表型，根据标准方案生成了皮质脑类器官（CO）的3D培养物（图3a）。根据体外天数（divs）评估CO直径。div28，类器官直径在四个个体中均无法区分。然而，到div 52时，受影响的类器官明显小于未受影响的类器官（图3b、c）。div90，绝大多数未受影响的CO>5 mm，而受影响的CO<5 mm。这些结果表明，NARS1患者的CO尺寸减小，模拟了患者小头畸形。
图3. NARS1患者CO显示体积缩小和分化受损。（a）实验工作流程示意图。（b）在div 28、52和90时，与对照组相比，iPSCs A1和A2产生的CO体积缩小。（c）CO直径差异。（d-g）患者CO的形态和细胞表达受损。（h）花环样神经数量的示意图和定量。（i）花环样神经直径的定量和示意图。
4 患者CO显示RGC生成减少
在CO中，SOX2+-RGCs通常存在于玫瑰花结中，被TUJ1+有丝分裂后神经元包围。而来自未受影响个体的CO表现出由TUJ1+有丝分裂后神经元包围的形成良好的致密SOX2+玫瑰花结，来自受影响个体的CO组织不良，缺乏形成良好的玫瑰花结或TUJ1+细胞。虽然SOX2+玫瑰花结没有典型的球形外观，但有不规则形状的空腔，周围有微弱的SOX2+细胞，但很少有强阳性的SOX2+细胞（图3d，e）。与未受影响的CO相比，受影响的CO中典型球形SOX2+花环的数量以及SOX2+花环的厚度（以直径测量）显著降低（图3f，g）。
5 scRNA-seq揭示了RGCs的细胞周期缺陷
采用scRNA-seq解析未受影响和受影响的CO中的细胞组成（图4a）。根据已知标记基因的表达，鉴定了4个主要细胞群（RGC、Neuron、IPC、Astrocyte）和23个亚群（图4b-d）。在RGC中，发现在受影响的CO中几个亚群显著减少（图4e）。GO-term基因功能分析证实了这一结果，表明NARS1在细胞周期控制中发挥作用（图4f）。用来自未受影响CO和在几个分化阶段受影响CO的cDNA进行qPCR验证，证实CCND2 mRNA表达减少（图4g），表明在受影响的CO中，以牺牲神经元为代价，改变了向星形胶质细胞的细胞命运。
图4. scRNA-seq表明患者放射状胶质细胞的细胞周期缺陷。（a）scRNA-seq的实验工作流程。（b）t-SNE图显示div 52的CO中有4个主要的细胞群和23个详细的细胞亚群。（c）div 52时四个主要细胞群的热图。（d）t-SNE图显示了标记基因在不同细胞群中的表达。（f）GO功能富集分析。（g）细胞群中KI67和pH3的表达差异。（h）RT-qPCR显示受累CO中Cyclin D2（CCND2）表达减少。
6 患者来源的CO中RGC活力降低
为了验证scRNA-seq结果，通过免疫荧光评估了CO神经花环的增殖标志物。观察到与未受影响的玫瑰花结相比，受影响的玫瑰花结中Ki67+细胞群减少（图5a、b）。WB分析证实家族MIC-2116中患者的CO中总Ki67蛋白减少（图5c）。CC3细胞在受影响的CO中很明显，但在未受影响的CO中几乎检测不到（图5a）。M期标记物pH3染色表明受影响CO中的有丝分裂缺陷（图5d,e）。顶端极性标记物αPKC定位于顶端连接处，但受影响的CO中这些区域通常塌陷且组织不良（图5f）。
CO显示3个皮质层：脑室样区（VZ）、脑室下样区（SVZ）和皮质板样区（CP）（图5g），但受影响的CO显示各层组织不佳。代表中间祖细胞的TBR2的分布在CO细胞群中没有显著改变（图5h-i），但在受影响的CO中观察到CTIP2+细胞的分布明显减少，表明早期出生的深层皮质祖细胞丢失（图5h，j）。总之，这些结果表明受影响的CO中祖细胞内增殖的丧失与形态缺陷和较小的类器官相关。
图5.受累皮质类器官放射状胶质细胞增殖减少。（a）div52时受累CO中VZ-Ki67+减少和CC3+增加。（b）Ki67+细胞归一化为DAPI+细胞。（c）在div52受影响的CO中Ki67水平降低。（d）div 52时受累CO中的磷酸化H3+（pH3+）细胞减少。（e）DAPI+细胞标准化的pH3+细胞的定量。（f）αPKC+顶端信号减少影响div 52的CO（箭头）。（g）CO中层形成示意图。（i,j）TBR2和CTIP2的定量。
结论
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