科研|J EXP BOT（IF：5.908）：多组学联合分析拟南芥在低氮低硫条件下分子变化研究
编译：微科盟 寒江雪，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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植物对氮和硫有依赖，当它们的供应不充足时，它们经常不得不应对长期的限制条件。本研究旨在研究低硝酸盐(Low-N)和低硫酸盐(Low-S)胁迫下拟南芥叶片在代谢、蛋白质和转录水平上的变化，以比较它们的影响，确定它们之间的相互联系，并研究它们的适应策略。代谢物组分析显示，低硫和低氮对碳水化合物和氨基酸积累的影响相反，而蛋白质组学数据显示这两种处理都导致分解代谢过程增加，线粒体和胞质代谢受到刺激，叶绿体代谢减少。低氮低硫条件下核糖体蛋白和翻译因子丰度较低，与生长受限相对应。在转录水平上，低氮主要作用是促进防御和免疫基因的表达。低硫的主要作用是细胞分裂、DNA复制和细胞骨架相关基因转录减少，自噬基因表达增加。此外，低硫还降低了几个NLP转录因子的表达，这些转录因子是硝酸盐感知的主要因子。转录组和蛋白质组数据都表明，低硫抑制硫代葡萄糖苷的合成，低氮加剧硫代葡萄糖苷的降解。这说明硫代葡萄糖酸盐作为氮、硫管理的缓冲分子的重要性。
论文ID
原名：Integrating multiple omics to identify common and specific molecular changes occurring in Arabidopsis under chronic nitrate and sulfate limitations
译名：整合多组学分析在低硝酸盐和硫酸盐条件下拟南芥中的共同和特异的分子变化
期刊：Journal of Experimental Botany
IF：5.908
发表时间：2020年7月
通讯作者：Céline Masclaux-Daubresse
通讯作者单位：巴黎-萨克莱大学
DOI号：10.1093/jxb/eraa337
实验设计
结果
1 低N-和S-导致代谢物的特异性改变
低氮或硫的供给对植物的生长有严重的影响。利用GC-MS分析，在对照、低硝酸盐(Low-N)和低硫酸盐(Low-S)条件下培养60d的拟南芥植株中共有120种代谢物。在低氮或低硫条件下生长的植株中有54种物质与对照组相比浓度有显著差异（图1和2）。利用LC-MS对脂质、辅因子、谷胱甘肽和核苷酸的分析也显示了不同营养条件之间代谢物的显著差异。光谱分析结果表明，低氮条件下硝酸盐浓度降低了3倍，低硫条件下影响不大；硫酸盐浓度在低氮条件下降低了12倍，在低氮条件下略有增加(1.5倍)。
与对照相比，限制氮后，糖类(CHO和己糖)、脂类(MGDG、DGDG和GIPC)以及参与三羧酸(TCA)循环的酮酸(苹果酸、柠檬酸、乌头酸和2-氧戊二酸)的浓度显著增加（图1）。低氮条件下ADP浓度较高，ATP浓度较低，ATP/ADP比值较低。在CHO代谢方面，甘露糖、蜜二糖、半乳糖、棉子糖、半乳糖醇、葡萄糖酸和半乳糖酸增加，只有赤藓糖醇在低氮条件下被耗尽。脱氢抗坏血酸和α-生育酚浓度升高，还原型谷胱甘肽（GSH）降低，氧化谷胱甘肽（GSSG）升高，表明低氮条件下的氧化应激程度较高。氨基酸浓度没有以类似的变化趋势。谷氨酸和天冬氨酸在低氮条件下含量更高，谷氨酰胺和脯氨酸在低氮条件下含量更低。因此，与脯氨酸途径相连的鸟氨酸在低氮植物中含量较低，腐胺和亚精胺聚胺类也是如此。属于甘氨酸/丝氨酸途径的氨基酸在低氮条件下也较少，苏氨酸和丙氨酸也较少。蛋氨酸和色氨酸是硫代葡萄糖苷的两种前体，在低氮条件下含量更丰富。
与低氮处理相比，低硫条件下生长的植物中代谢产物的变化较少（图2）。除甘露糖降低外，CHO与对照组相比几乎没有变化。虽然葡萄糖和果糖在低硫状态下含量较低，但它们的磷酸化形式葡萄糖6-P和果糖6-P含量更高。同样，在低硫条件下，肌醇浓度低于对照，而肌醇-1-P浓度在低硫条件下高于对照。低硫条件下磷酸盐含量也较高。在低硫条件下，甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的浓度均较高，除后两种外，其余均与低氮条件下的浓度相反，在低硫条件下，甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的浓度均较高。在氨基酸中，只有鸟氨酸和半胱氨酸在低硫条件下含量较低。GSH和GSSG的含量也较低，这一点两个条件是一致的，因为谷胱甘肽的合成需要半胱氨酸。蛋氨酸不受低硫修饰。低硫处理下脂类的合成依赖于乙酰辅酶A，然后依赖于硫代谢，其含量较低，与低氮处理相反。由于生育酚主要与叶绿体膜和脂体结合，这与低硫条件下观察到的较低浓度的MGDG和DGDG脂类是一致的，这表明叶绿体存在缺陷。所有检测到的核苷酸在低硫条件下的丰度都较低。
图1.与对照相比，低硝酸盐条件下的代谢产物发生了变化。
图2.与对照相比，低硫酸盐条件下的代谢产物发生了变化。
2 当硝酸盐或硫酸盐受到限制时，叶片蛋白质组被修饰
用XIC对对照、低氮和低硫植株的莲座进行蛋白质组分析，共鉴定出2334个蛋白质。与对照相比，低氮处理组有965个差异蛋白(DAP)，低硫处理组有676个DAP（图3A）。在低氮条件下，645个DAP上调，320个下调；在低硫条件下，350个DAP上调，326个下调。与对照相比，低氮和低硫的共有DAP包括210个上调DAP和140个下调DAP，占总DAP的27%。在低氮和低硫条件下，DAP的预测细胞位置大多相似（图3B）。在低氮或低硫条件下，上调的DAP主要分布在线粒体、胞外间隙和胞内间隙。下调的DAP主要分布在质体和胞质中。
图3.低硝酸盐(Low-N)或低硫酸盐(Low-S)条件下生长60d的拟南芥莲座叶中显著差异蛋白(DAP)。A 上调和下调DAP数量。B 根据SubBA4预测的DAP的细胞定位。C DAP的GO注释分析，基因家族，AraCyc途径和KEGG注释分析。
3 低氮条件下叶片蛋白质组修饰反映了类似衰老的分解代谢过程
对低氮条件下的DAP进行了GO富集分析。生物过程方面DAP主要富集在“新陈代谢过程”和“对刺激的反应”功能。分子功能方面上调DAP主要富集在“氧化还原活性”、“肽酶和水解酶催化活性”、“抗氧化活性”和“离子结合活性”四种功能。下调DAP主要与N代谢过程有关，包括“细胞氮化合物代谢”、“四吡咯代谢”和“氨基酸代谢”。低氮条件下，下调DAP主要富集在与裂解酶有关的分解代谢活动和结构分子。
对DAP进行基因家族、AraCyc途径和KEGG富集分析（图3C）。发现在低氮条件下，上调DAP主要参与蛋白质、氨基酸、脂质和细胞壁的降解，参与主要和次要CHO的代谢，参与氧化还原和抗氧化活性，以及与线粒体TCA循环、线粒体电子传递和胞质戊糖磷酸途径相关的能量代谢。下调DAP主要参与光合作用和光呼吸，参与四吡咯、质体氨基酸、细胞壁和叶绿体脂肪酸的合成，参与蛋白质的翻译和合成，以及水分运输(水通道蛋白)。低氮条件下DAP的功能反映了分解代谢途径的加剧和叶绿体产能功能的减弱，同时线粒体和胞质能量途径的增加也证明叶绿体功能的减弱。对低氮DAP的GO分析所反映的代谢物的变化吻合，CHO和糖的含量较高，TCA酮酸的含量较高，许多氨基酸，特别是富含氮的氨基酸，如谷氨酰胺和脯氨酸的耗竭。
低氮DAP的代谢谱与之前研究中的叶片衰老的代谢物的变化十分相似，这与硝酸盐饥饿/限制是衰老的主要触发因素的事实是一致的。低氮DAP中，参与硝酸盐初级同化的酶降低，而参与氮循环和再活化的酶升高（图4）。许多与蛋白质降解有关的酶也升高，其中有几种酶参与诱导衰老，并在氮再活化中起作用。类木瓜蛋白酶SAG12是叶片衰老和氮素再活化过程中诱导和积累最高的半胱氨酸蛋白酶之一，但在本研究的低氮条件下并没有上调，反而比对照组下调（图5A）。除已知由叶片衰老诱导的CLPD(又称ERD1或SAG15)外，所有的CLP叶绿体蛋白酶在低氮条件下含量都较低。与类囊体蛋白降解有关的几种叶绿体蛋白酶的降解在低氮条件下也上调，这可能与低氮下叶绿体蛋白水平较低，特别是叶绿素结合蛋白丰度较低相一致。还发现几种蛋白酶体蛋白的上调，这可能表明低氮条件下蛋白酶体活性较高，蛋白吞噬能力较低。
氮再活化的潜在蛋白质底物，如核糖体蛋白(图5B)和叶绿体蛋白(图6)与对照相比，在低氮条件下蛋白丰度一直较低，参与光合作用或光呼吸的叶绿体蛋白丰度较低，与类衰老表达模式一致。叶绿体核糖体蛋白的减少与几种胞质核糖体蛋白、起始因子、延伸因子和tRNA连接酶的降低是平行的，这表明在低氮条件下翻译机制的活性低于对照。叶绿体光合器相关的DAP丰度较低伴随着相应转录本的降低。表明低氮条件下光合蛋白水平的降低不仅是由于叶绿体的降解或变动，还与这些DAP编码基因的下调有关。在叶片衰老过程中，线粒体一直保持活跃，直到后期，能量代谢在很大程度上是由细胞质和线粒体酶支持的。在低氮条件下，与新葡萄糖生成、磷酸戊糖途径、糖酵解和三氯乙酸循环相关的许多酶比对照上调（图7）。
图7.低硝酸盐和低硫酸盐条件下，参与糖酵解、三氯乙酸循环和戊糖磷酸途径的蛋白质的丰度增加。
4 低氮和低硫条件下蛋白质组的共同变化
DAP的GO注释分析表明低氮和低硫生长条件蛋白质组有几个相似的影响。对低氮和低硫的350个共有DAP进行GO分析。上调DAP主要在氧化还原和肽酶/水解酶催化活性富集，下调DAP在核糖体的结构分子和组成富集。低硫和低氮处理的共同效应是加剧了碳水化合物/淀粉降解途径和TCA能量代谢，富集了茉莉酸合成相关蛋白的DAP上调。DAP在翻译和蛋白质合成(核糖体、真核起始因子)、叶绿体代谢(光合作用、光呼吸)、水通道蛋白、膜ATP酶等蛋白质，参与脂质合成的多个步骤中富集。转录因子Whirly1在低氮和低硫条件下均显著降低。在拟南芥和大麦中，Whirly1是控制叶绿体-胞质溶质信号和叶片衰老开始的一个重要因素。因此，本研究结果表明Whirly1也可以调控对低硫的响应。
5 蛋白质组的变化突出了硝酸盐和硫酸盐对氮和硫代谢的交叉影响
硝酸盐的有效性会影响硫的吸收和代谢，硫酸盐的有效性会影响氮的代谢。氮和硫都是氨基酸的组成部分，因此缺乏这两种元素可能会减弱氨基酸的生物合成，此外还会影响蛋白质的翻译。低硫导致ATPS1和ATPS2丰度降低，低氮也降低了ATPS2丰度（图8A）。亚硫酸盐还原酶的表达也响应低氮处理。低氮处理也导致两种半胱氨酸合成酶（OASC和CYSC1）上调，质体半胱氨酸合成酶OASB下调，但半胱氨酸本身的浓度保持不变。相反，胱硫醚γ合成酶CGS1下调，也解释了低氮条件下蛋氨酸比对照条件下更高（图8A，图2）。低氮和低硫对谷胱甘肽和硫代葡萄糖苷途径的影响不同（图8B和C）。谷胱甘肽和硫代葡萄糖苷的合成都需要氮和硫。参与谷胱甘肽途径的酶在低氮条件下大多上调，在低硫条件下下调。低氮条件下谷胱甘肽S-还原酶和上调DAP的变化主要与谷胱甘肽合成甘氨酸或谷氨酸的途径有关。GSH1、GPX1和DHAR3以及参与GSH向R-S-谷胱甘肽转化的几种酶在低硫条件下含量较低。在低硫条件下，参与硫代葡萄糖苷合成的许多酶的丰度较低，而低氮主要上调了参与硫代葡萄糖苷降解的酶的丰度。由于谷胱甘肽和硫代葡萄糖苷都是氮源，它们途径上的这些反应与氮循环过程的加剧是一致的。蛋白质组学数据也揭示了低硫对氨基酸代谢的强烈影响，如图4所示；然而，低硫对单个氨基酸途径的影响与低氮诱导的变化有很大不同。
图8.低硫酸盐和低硝酸盐都会改变与硫酸盐同化、谷胱甘肽和硫代谢物有关的酶的蛋白质含量。
6 蛋白质组与转录组的变化不匹配
对转录组数据进行差异基因分析（DEG），在低氮条件下有2447个DEG，低硫条件下有5136个DEG（图9）。蛋白质组结果中低氮条件下的DAP数量大约是低硫条件下的两倍，而转录组中低硫条件下DEG数是低氮条件下的两倍，转录组数据和蛋白质组数据间的相关性较差。在低氮和低硫条件下分别有102个和53个基因在转录水平和蛋白质组水平上都有反应，有20个基因在氮N和低硫条件下都有反应。
图9.转录组揭示了低硝酸盐和低硫酸盐条件下基因表达的变化。
7 低氮条件下转录组的变化揭示了防御基因的增强
在低氮条件下，许多DEG与氮代谢有关。与对照组相比，在低氮条件下几个硝酸盐反应转录因子(TF)表达上调，在氮和磷信号交叉点的通路中发挥作用的基因下调。硝酸盐转运蛋白AtNRT2.5上调，液泡膜硝酸盐/质子交换器的CLC-A和CLC-B氯通道下调。参与氮再活化的胞质谷氨酰胺合成酶基因上调，编码负责硝酸盐初级同化的主要酶的基因下调。蛋白组分析中鉴定为DAP的N-再活化肽酶都不在低氮DEG中。
低氮对转录修饰的主要影响与胁迫反应有关，特别是与植物防御和免疫有关（图9）。低氮条件上调的DEG包括与信号转导有关的基因(受体、激活子)，参与次生代谢(类黄酮合成、萜类降解、脱落酸降解)的基因等。下调DEG的GO注释主要包括各种胁迫在内的刺激反应，以及许多碳水化合物途径，表明以叶绿体为靶标的结构蛋白和酶的下调，这与光合作用和蔗糖合成基因的表达降低相对应。
氮素缺乏会加速叶片衰老，许多与叶片衰老相关的基因与植物对病原菌的反应有关。本研究数据表明在低硝酸盐下生长的植物增强了防御基因的表达，这是否真的会增加它们对病原菌的抗性或耐受性还有待证实。
8 低硫条件下转录组中自噬基因表达增强，对细胞分裂和NIN蛋白TF家族有负面影响
虽然代谢组和蛋白质组数据显示低硫条件下的变化比低氮条件下的小（图3A），但是低硫条件下的DEG要远高于低氮条件（图9）。在低硫条件下，许多DEG与硫代谢有关，也与氮代谢有关。与硫代葡萄糖苷合成相关的基因相比，参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢的基因表达相对较少。低硫状态下，硫代葡萄糖苷合成相关基因表达下调，硫代葡萄糖苷降解相关基因表达上调与蛋白质水平变化一致。与谷胱甘肽氧化还原途径相关的DEG上调。本研究中没有发现硫响应的差异表达TF，但是调控硫代葡萄糖苷合成的转录抑制因子上调。参与蛋氨酸依赖性硫代葡萄糖苷合成调控的表达下调，调控色氨酸合成的TF表达也下调。
本研究数据发现低硫也影响氮的代谢。在低硫胁迫下，谷氨酸合成酶基因表达下调，谷氨酸脱氢酶基因的表达也有显著差异。在低硫转录组数据中发现很多参与N再活化和N转运的多肽酶和氨基酸转运蛋白。研究结果还发现低硫条件下自噬活性较高，低硫同样导致硫化物和葡萄糖减少，硫化物和葡萄糖抑制了雷帕霉素(TOR)激酶的活性靶增强了自噬活性。
对低硫条件下的DEG进行GO富集分析。上调DEG与编码液泡、胞浆、质膜和过氧化物酶体中预测的蛋白质相关，但不编码叶绿体中的蛋白质。蛋白质组学分析显示在低硫条件下，核糖体蛋白的积累较少，与转录组结果相反（图4）。
核糖体蛋白DAP和DEG几乎没有匹配，表明在低硫条件下蛋白质翻译机制发生了重大变化。低硫条件下较低丰度的核糖体蛋白DAP主要在叶绿体和细胞质中，这与低硫条件下叶绿体核糖体蛋白基因的下调一致。上调的核糖体蛋白基因主要是在胞浆和线粒体中。分子功能方面，反映了低硫对氧化还原的影响，特别是对谷胱甘肽S-转移酶活性的影响。生物过程、AraCyc、KEGG和基因家族分析说明了生物/非生物胁迫、解毒和次生代谢相关的基因富集，这与蛋白组学结果一致。
低硫条件下的DEG功能分析表明硫代葡萄糖苷合成途径的下调和NLP TF的抑制。细胞组分中细胞骨架、膜质和膜结合细胞器相关的基因高度富集。分子功能和KEGG功能注释表明下调的DEG与微管运动活性、动蛋白/肌球蛋白、DNA重组/复制/修复、核苷酸结合、端粒维持以及细胞和染色体组织相关。因此，许多与维持细胞分裂有关的基因在低硫条件下调。代谢组数据分析显示，在低硫环境下，谷胱甘肽含量减少，虽然低硫条件是否会影响谷胱甘肽从胞浆到细胞核的运动还有待确定，但数据清楚地表明，谷胱甘肽代谢和细胞周期的扰动之间是一致的。
结论
1 科研│山东农业大学：综合转录组和蛋白质组分析揭示玉米种子萌发过程中氯化钠响应基因网络（国人佳作）
不来关注一波嘛
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