科研 | Nature Communications：人类黑质单细胞图谱揭示了与神经系统疾病相关的细胞特异性途径
编译：小鹿同学，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：A single-cell atlas of the human substantia nigra reveals cell-specific pathways associated with neurological disorders
译名：人类黑质单细胞图谱揭示了与神经系统疾病相关的细胞特异性途径
期刊：Nature Communications
IF：12.121
发表时间：2020年8月21日
通讯作者：Caleb Webber
通讯作者单位：英国牛津大学遗传学、解剖学和生理学系，牛津大学帕金森症研究中心
DOI号：10.1038/s41467-020-17876-0
实验设计
结果
人类黑质（SN）和大脑皮层的单细胞核测序
研究者使用10×Genomics Chromium平台分别对来自大脑皮层（额中回）和SN（来自五个人类死后大脑的12个成对样本（包括两个SN重复））的10,706个细胞核和5943个细胞核的转录组谱进行了测序。研究者在SN内的所有样本中鉴定了十个不同的细胞群（图1a），其中包括：（i）具有两种亚型的星形胶质细胞（GFAP）：表达神经炎性基因的星形胶质细胞-1群体（OLR1）以及表达与生长和修复功能相关基因的星形胶质细胞-2群体（GINS3）；（ii）少突神经胶质细胞（ODCs）（MOG，MOBP），其根据少突神经胶质细胞的标志基因（PALM2，LGALS1和PPM1G）来区分三种亚型；（iii）内皮细胞（RGS5）；（iv）小胶质细胞（CSF1R）；（v）少突胶质前体细胞（OPCs）（VCAN）；（vi）多巴胺能神经元（DaNs）（TH和SLC6A3），黑质致密部的神经元集群；（vii）GABA能神经元，表达γ-氨基丁酸（GABA）受体GABRA1和GABRB2以及合成GABA神经递质所需的酶GAD1和GAD2的黑质致密部神经元集群（图1a，1c）。在大脑皮层中，研究者确定了六个不同的细胞群，其中包括：星形胶质细胞、兴奋性神经元（Ex），抑制性神经元（In）、ODCs、OPCs和小胶质细胞，但内皮细胞中没有明显的簇（图1b）。SN和大脑皮层区域的联合聚集分析表明，大脑皮层和SN是按细胞类型（神经细胞、ODC、星形胶质细胞、小胶质细胞、OPC和内皮细胞）而不是按区域来形成不同的簇（图1d，1e）。
相比于从大脑皮层的神经胶质（12%的神经胶质）中捕获的，研究者在SN的神经胶质（主要由ODCs代表，占总神经胶质的72%）中捕获了更高比例的单细胞核。由于本研究中的大脑皮层和SN图谱是由同一个体通过相同的过程而生成的，因此神经胶质的这种比例差异可能反映了不同大脑区域中细胞组成的真正差异。本研究SN图谱中观察到的不同细胞群的比例与组织病理学中的研究一致，据报道，ODCs是最常见的神经胶质细胞群（在所有大脑区域中占45%~75％，对于SN而言为62％），同时，近期组织内细胞类型组成相关的生物信息学预测结果也与此一致。尽管个体间样本和个体内样本之间捕获的细胞类型数量存在显著差异，但研究者观察到重复样本之间、样本和大脑区域之间按细胞类型划分的聚类趋于一致，这表明研究者已经反复捕获了相同的常驻细胞群体。
复杂性状遗传学突出了不同的脑细胞类型。
研究者使用了来自人类SN转录组学细胞图谱的细胞类型特异的基因表达模式，通过两种不同的方法（LD得分回归分析（LDSC）和基因组注释的多标记分析（MAGMA））来鉴定特定的SN细胞类型，其中有助于30种人类复杂性状的遗传变异可能通过这些特定的SN细胞类型来发挥作用。研究者首次在人类中观察到PD遗传风险与具有DaN-特异性表达模式的基因之间存在显著关联（qMAGMA=4.6×10-3；图2a），这得到了近期使用预测的PD GWA-风险基因的小鼠表达模式研究的支持，同时对比研究表明PD风险与神经元无关。研究者还确定了PD遗传风险与具有ODC特异性表达模式的基因之间存在第二种关联（qMAGMA=0.035；图2a）。为了评估与DaN或OPC细胞类型相关的PD遗传风险部分是重叠的还是不同的，研究者以ODC或DaN基因为参照，通过LDSC方法进行条件分析：研究者发现促成ODC关联的PD遗传风险部分与DaNs关联的部分明显不同（与LDSC系数相关的p值<0.05（此时，p=7×10-3）），从而提出了SN内存在不同的PD-相关细胞病因。在大脑皮层图谱中，研究者发现Ex神经元细胞与PD遗传风险变异之间存在显著相关（qMAGMA=6.1×10-3；图2b）。本研究设计采用了大脑皮层/SN的成对组织样本，从而能够对这两个大脑区域的细胞类型进行条件分析，且不会受个体/研究变异的影响。研究者通过随机采样原始细胞群体，创建了人为匹配的具有相同比例神经胶质细胞的SN/大脑皮层细胞图谱，从而研究SN和大脑皮层之间不同比例的神经元/神经胶质细胞对遗传风险/细胞关联的影响。研究者观察到在原始细胞和同源细胞图谱之间的遗传风险/细胞关联性存在很大的一致性（SN R=0.83（p<10-16）；大脑皮层R=0.72（p<10-16）），这表明细胞的比例并不会掩盖同一组织内细胞类型的关联性。然而，仅在同源细胞图谱中进行跨组织细胞类型的条件分析显示，与SN DaNs和大脑皮层Ex基因表达谱相关的PD遗传风险是无法区分开的（p=0.15（同源细胞图谱）/p=0.049（原始细胞图谱））。同时，研究者观察到已知的PD风险基因通常在整个SN的神经元细胞类型中具有更高的表达。
图2.鉴定与多种人类复杂性状相关的大脑细胞类型。研究者使用两种方法从（a）黑质和（b）大脑皮层中鉴定不同复杂性状的遗传风险变异与细胞类型之间的关联：分层的LD得分回归分析（LDSC）（与LDSC系数相关的p值）和MAGMA基因组分析（单阳性的两样本t检验）。热图的颜色表示这两种方法或两种方法中的一种显著的不同程度，星号（*）和双星号（**）表示名义上显著的p值（<0.05）和q值（对所测细胞类型的数目进行Bonferroni校正）。不同性状按类别分类：认知表型（Cog）；自身免疫性疾病（Immune）;代谢、心血管和人体测量学等性状（Metabolic/Cardio/Anthropometric）；神经系统疾病（Psychiatric disorders）。
研究者的SN图谱将神经精神疾病的遗传风险与DaN基因的表达联系起来了，同时其也与GABA能基因的表达相关，如精神分裂症（SCZ）（DaN和GABA）（图2a）。但是，SN内细胞类型之间的条件分析表明，在DaN和GABA能神经元均与神经精神疾病相关的情况下，当GABA神经元出现表达的时候，疾病与DaNs之间的联系就消失了，反之则不会出现这样的情况。因此，相比于黑质致密部的DaNs来说，这些神经性疾病的遗传风险更广泛地与黑质网状部的GABA能神经元中的表达基因相关。正如先前的报道，研究者在大脑皮层中发现Ex和In神经元与神经精神障碍（如SCZ）的细胞类型都有明显的关联，并且这些关联通常与SN神经元之间的关联不同，由此提出了SN在神经精神疾病（尤其是SCZ）的病因中发挥着独特作用。此外，针对不同的神经精神疾病，研究者发现了显著不同的寡聚型关联（如具有两种SN神经胶质细胞群的SCZ，即OPC（qLDSC=4.27×10-3，qMAGMA=1.32×10-4）和ODC（qMAGMA=1.36×10-5））（图2a）。这些关联支持了以下假设：对于许多脑部疾病，神经胶质细胞可能会导致神经元的改变。在本研究中，对于SN（qMAGMA=9.81×10-4）和大脑皮层（qLDSC=0.01，qMAGMA=7.2×10-4）中的小胶质细胞，AD的风险变异与其表达基因之间的关联很好地阐明了这一点（图2），而且这两个大脑区域中小胶质细胞群之间并没有区别（p=0.84）。
不同的神经精神疾病之间的遗传风险存在明显的重叠。在对另一种疾病的遗传风险影响进行条件调整后，研究者通过对一种疾病的遗传风险进行重新的细胞关联分析，从而检查两种神经精神疾病之间的常见细胞类型关联是否与这些疾病之间的共同遗传风险相关联。总之，这些条件分析表明，这些疾病之间的风险重叠部分与OPCs相关，而遗传风险的明显非重叠部分则通过相同的神经元类型发挥作用（图3）。在某些情况下，研究者注意到当调节其它疾病的风险（例如，GABA能神经元和ADHD或Ex神经元和焦虑症；图3）时，细胞特异性关联会以不可逆的方式消失，这反映出该疾病的细胞特异性遗传风险关联受到了更严格的限制。
图3. 评估成对神经精神疾病之间共享的细胞类型关联。评估任何两种神经精神疾病之间的相似细胞类型关联，从而识别SN中细胞类型（顶部）和大脑皮层中细胞类型（底部）的任何共享的细胞类型特异性风险组成。每个热图代表了在调整另一种神经精神疾病（疾病2-Y轴）的遗传风险后，特定细胞类型的表达谱与给定神经精神疾病（疾病1-X轴）的遗传风险相关性的LDSC结果（与LDSC系数相关的p值）。仅在两种神经精神疾病显示出与相同细胞类型有显著相关的情况下进行此分析（图2）。蓝色热图的颜色与针对另一种疾病调整后的疾病相关遗传变异的富集度-log10 q值（FDR校正过的p值）成比例。未评估的细胞关联（图2中非重叠部分）以深灰色着色。
最后，研究者还发现在SN细胞类型中特异性表达的基因与非大脑特有的性状相关。研究者在小胶质细胞和与高密度脂蛋白（HDL）胆固醇水平（qMAGMA=0.046）相关的遗传变异之间发现了独特的细胞类型特异性信号（图2a）。考虑到脂质在AD中的作用，研究者提出HDL胆固醇关联与AD风险和小胶质细胞基因表达之间的关联是否相关（图2a）。但是，条件分析表明不同的遗传基因是AD和HDL胆固醇水平与小胶质细胞之间联系的基础。
遗传风险强调了细胞类型特异的网络和途径
SN和大脑皮层中细胞类型特异的基因表达模式可能有助于确定以相关疾病的细胞类型特异性缺陷为基础的细胞通路。研究者使用蛋白质间相互作用（PPI）作为基因之间功能关系的证据，建立了细胞类型特异的PPI网络，在其中研究者鉴定出许多高度连通的基因模块。对于以上发现的每一个显著的细胞类型/疾病-风险的关联（图2），研究者希望通过MAGMA基因组分析将疾病-风险关联细化为相关的细胞类型特异性基因模块（图4）。PD风险显示出与黑质DaN模块（M1和M2）（图4b和图5）相关，而在先前的研究中该模块与PD相关，如线粒体的组织和运作、内吞作用、蛋白质的泛素化作用和自噬。与ODCs（M5）关联的PD风险与代谢过程、基因调控、激酶活性、蛋白质磷酸化和神经系统发育等过程中富集的基因相关，而OPC风险相关模块（M1）在代谢过程、基因调控和细胞分化等过程中富集。与大脑皮层神经元集群关联的SCZ-风险主要与突触的信号传导和神经元发育过程相关（分别为Ex神经元模块M1/In神经元M1和Ex神经元模块M4/In神经元M4；图4a）。在黑质的神经元集群中，DaN模块M4和GABA模块M3（与突触的信号传导/神经元的发育相关）中的基因也在SCZ风险中出现了富集（图4b）。研究者发现与DaN（M1）进一步相关的SCZ与线粒体有关（图4b），这支持了线粒体功能障碍在SCZ中的作用。脂质代谢和神经元发育被发现在与SCZ风险相关的大脑皮层ODCs模块（M2）和OPCs模块（M4）中出现富集。此外，研究者发现与神经系统发育和突触信号传导相关的黑质OPCs模块（M3和M5）与SCZ风险相关（图4b）。黑质OPC M3模块还显示出与其它性状（如神经质）存在显著关联（校正后的p值为0.004）。正如遗传风险所预测的那样，与突触信号传导和神经元发育相关的黑质DaN模块（M4）与双相情感障碍（BP）相关（图4b）。
图4. 与三种遗传性脑部疾病的遗传风险相关的细胞类型特异性途径。大脑皮层（a）和黑质（SN）（b）中细胞类型特异的蛋白质间相互作用（PPI）基因模块在帕金森氏病（PD）、精神分裂症（SCZ）和双相情感障碍（BP）等疾病风险中富集的基因本体论（GO）富集分析。研究者使用MAGMA基因组分析（单阳性的两样本t检验）在细胞类型特异性PPI基因模块的功能水平上测试了疾病遗传风险的趋同现象；星号（*）和双星号（**）分别表示名义上显著的p值（<0.05）和q值（对所测试的细胞类型PPI模块数量进行了Bonferroni校正）。图中显示了对于具有PD、SCZ或BP风险富集的细胞类型模块来说，最具代表性的GO生物学过程术语，这些模块在更普遍的细胞类型水平分析中具有重要意义（图2）。圆圈的大小代表Fisher检验中GO富集的-log（p值）。颜色与细胞类型相对应（DaNs：多巴胺能神经元；Ex：兴奋性神经元；GABA：GABA能神经元；In：抑制性神经元；ODC：少突神经胶质细胞；OPC：少突胶质前体细胞）。
图5. 帕金森氏症风险相关基因的细胞类型特异性蛋白质间相互作用网络（PPI）。蛋白质间相互作用网络（PPI）代表了黑质（SN）多巴胺能神经元（DaN）特异模块DaN_M1（a）和DaN_M2（b）中的帕金森氏症风险相关基因。研究者展示了在帕金森氏症风险相关的两个DaN特异PPI基因模块中发现的每个模块内的所有基因（图4），并根据帕金森氏症风险关联基因的MAGMA校正后Z得分对每个基因进行上色，颜色越深，则校正后Z值越高，帕金森氏症的风险关联性则越强。基因之间连线代表这些基因的蛋白质产物之间存在相互作用。
然后，研究者评估了两种疾病之间相同细胞类型内的共同模块关联是否与这些疾病之间的共同遗传风险相关。为此，研究者在对另一种疾病的遗传风险影响进行了条件调整后，使用一种疾病的遗传风险重新进行了细胞特异性模块关联分析，反之亦然。对于与两种疾病相关的三个黑质模块（图4），研究者发现PD和SCZ与DaN模块M1之间的关联是独立的（对于以SCZ为条件的PD，p值= 0.0002；而以PD为条件的SCZ，p值=0.0009），且与PD相关的M1基因主要在内吞作用中富集（内吞作用的调节，GO:0030100 p值= 0.0003），与SCZ相关的M1基因主要集中在神经元迁移和发育过程中（神经元迁移，GO:0001764 p值= 0.0004）。同样的，研究者发现BP和SCZ与DaN M4之间的关联也是独立的（对于以SCZ为条件的BP， p值= 0.0003；对于以BP为条件的SCZ，p值= 0.002），且BP相关的M4基因主要在突触传递过程中富集（突触的信号传导，GO:0099536 p值=3.9e-05）,与SCZ相关的M4基因主要在神经元发育过程中富集（神经系统发育，GO:0007399 p值=6.3e-06）。相比之下，研究者发现以SCZ风险为条件时，黑质ODC M5模块与PD风险之间的关联丧失了（p值=0.23），但以PD风险为条件时，该模块与SCZ之间的关联仍然存在（p值=0.002），由此揭示了趋同现象，特别是SCZ风险的基因座出现重叠并包含了ODC M5 PD相关的潜在基因座。
讨论
本文中，研究者对大脑皮层和SN组织中大约17,000个单细胞核进行测序，从而报告了一个全面的人类SN单细胞核转录组图谱，其能够实现大脑区域特异性细胞类型的识别和比较。在这项研究中，（i）研究者重新鉴定了先前报道的所有主要的细胞类型，表明该图谱具有足够的基因/细胞覆盖率；（ii）研究者发现大脑皮层和SN之间神经胶质细胞的组成存在很大差异，这使大部分组织疾病的关联变得混乱（图1）；（iii）研究者发现特定疾病的遗传风险与黑质和大脑皮层中特定细胞类型之间存在多种关联（图2）；（iv）研究者发现对于给定的神经元类型，多个神经精神疾病与之相关联，同时每种疾病相关的基因座是不同的，且在该细胞类型内的同一组基因上似乎不会汇集，而对于胶质细胞，研究者确实观察到了趋同现象（图3）；（v）研究者确定了不同的细胞特异性基因网络及其功能，且它们受到疾病风险变异的干扰（图4和5）。
该SN /大脑皮层的成对样本图谱是解释许多疾病遗传结构的宝贵资源，尤其是PD以及与大脑皮层相比具有SN缺陷的其它疾病。但是，映射到大脑皮层Ex神经元的PD遗传风险部分与映射到SN DaNs的部分没有区别，因此仅本研究的图谱是无法解释为何SN DaNs在PD病理学中会出现早期丢失。本研究的细胞图谱表明在PD黑质和大脑皮层退化过程中，所有神经元细胞类型的PD遗传风险具有相似的细胞功能。因此，来自不同大脑区域的这些神经元的不同代谢需求以及不同局部环境可能导致了其明显的缺陷。PD遗传风险似乎也通过ODCs和OPCs表现出来（图2），这牵涉到代谢过程和细胞发育中的基因调控，并提供越来越多的证据，证实了神经胶质在神经退行性疾病中的作用。值得注意的是，研究者观察到已知的PD基因LRRK2在OPCs中的表达明显高于其它的SN细胞类型。考虑到SN DaN轴突的轻微髓鞘化，ODCs在PD中的作用令人惊讶，但本研究中相对公正的方法有利于进一步理解这些意外的关联。的确，多项研究已经确定了与病程相关的白质损伤似乎先于灰质萎缩的发生，而本研究结果可能提供了一个与PD遗传风险相关的分子关联。本研究发现的PD遗传风险变异与人类ODCs特异性基因表达之间的关联最近在一项利用小鼠转录组学数据的独立研究中被提出来了。与AD不同，研究者没有发现PD遗传风险与小胶质细胞之间存在关联，这表明神经炎症在PD风险中的作用可能要比在AD风险中的小。
对于几种神经精神疾病来说，中脑（包含SN）是继大脑皮层后的一个关键大脑区域。对于SCZ来说，研究者发现其与黑质神经元和大脑皮层神经元都有明显的关联。但是，这种SCZ-DaN关联可能与相邻的中脑腹侧被盖区（VTA）（先前报道其与几种神经精神疾病有关）内的DaNs相关。如果没有这些大脑相应的VTA图谱，研究者将无法进行相关的条件测试，这强调了未来需进行更大规模研究的价值，该研究应该能从同一大脑中捕获更多区域。由于DaNs在PD中起关键作用，因此黑质网状部中GABA能神经元在其它疾病中的作用仍处于研究当中。尽管如此，GABA能神经元仍通过中脑边缘系统通道投射到前额叶皮层和细胞核内，并主要控制大脑的奖励机制（了解环境中的动机相关刺激），该奖励机制在神经精神疾病患者中受到了影响，同时，研究者的新型关联表明这些神经元受多种神经精神疾病遗传风险的潜在影响。在几种神经精神疾病和神经退行性疾病中，研究者发现了多种神经胶质的相关性，尤其是与突触信号传导相关的OPC过程。
本文中，研究者描述了第一个全面的人类SN细胞类型图谱。该图谱连同相对应的大脑皮层图谱，可以对SN的细胞类型进行系统性表征，并识别受多种复杂疾病影响的特定细胞类型进程。
评论
识别与特定疾病相关的细胞类型是理解分子病因学背后因果过程的关键。许多疾病（神经疾病和精神疾病）都受到因遗传变异而改变的基因功能的影响。因此，当遗传变异与特定基因相关联时，这些基因的空间表达模式便可以将特定细胞类型与该疾病联系起来。帕金森氏病（PD）是最常见的神经退行性运动障碍，其主要特征是黑质（SN）中多巴胺能神经元（DaNs）的选择性丢失。虽然DaNs的丧失是PD病理的关键基础，但已有研究提出其它细胞类型（如星形胶质细胞和小胶质细胞）也会造成这种缺失。然而，目前人类SN的相关研究非常少。
本研究首次描述了一个全面的人类SN单细胞图谱，从而发现大脑区域的细胞多样性，并确定了区域特异性神经元和非神经元细胞类型之间的差异。从该细胞图谱中，研究者将一系列神经精神疾病的常见风险变异映射到特定的细胞类型，并对SN中PD和其它精神疾病的风险基因进行了细胞类型特异性的基因网络分析，从而为PD和其它精神疾病的病因提供了新见解！
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