综述 | 人类老龄化蛋白质组学系统综述和分析：揭示了一种新型的蛋白质组学老龄化时钟并确定随年龄变化的关键进程
编译：北越城主，编辑：Emma、江舜尧。
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通过临床干预措施的发展可显著改善人类健康水平，因此需要可靠的生理年龄标记物以及可靠的治疗靶点。为了实现这些目标，我们对人类衰老和蛋白质组学相关的研究进行了系统的综述和分析。本研究系统评价包括36种不同的蛋白质组学分析，每种分析都鉴定出随着年龄的增长而发生显着变化的蛋白质。同时研究发现至少有1,128种蛋白质具有两次以上研究报道，有32种蛋白具有五次或更多次研究报道。这32种蛋白质中的每一种都与衰老和年龄相关联。例如，GDF15蛋白在小鼠中过度表达时可以延长寿命，同时抗糖尿病药物二甲双胍通过GDF15发挥对体重和能量平衡产生有益作用。我们对1,128种常见的蛋白质进行的生物信息学富集分析，发现与炎症，细胞外基质和基因调控过程密切相关。我们还提出了一种新的蛋白质组学老化时钟，该时钟由三种或更多的蛋白质组成。在验证阶段我们同时对3,301名受试者（年龄在18-76岁之间）组成的大型患者队列研究，结果证明了该时钟能够准确预测人的年龄。
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文章结构
1.整理32篇不同论文和36种不同分析进行系统综述
2.两项或多项研究报到的多个蛋白质会随着年龄的增长而发生显着变化
3.先前已报道许多常见蛋白质与衰老有关
4.鉴定由五项或更多项研究报告的一小类随着年龄的增长而变化常见蛋白质
5.在五项或更多的研究中，所有发现随年龄变化的蛋白质都与衰老和/或与年龄有关的疾病有关
6.常见蛋白质的富集分析可确定随年龄变化的关键过程
7.推荐血浆蛋白检测板用于人类衰老生物标记
8.新型蛋白质组老化时钟可准确预测大型患者队列中的患者年龄
实验结果
1. 整理32篇不同论文和36种不同分析进行系统综述
我们首先进行了详尽的文献搜索，以发现出在人类衰老过程中会显着改变其表达水平的蛋白质。这项搜索发现了32篇不同的论文，其中一篇对5种不同的骨髓衍生细胞类型进行了蛋白质组学老化分析。因此，系统综述总共包括36种不同的老化分析。年龄范围从新生儿（<1岁）到95岁。每个研究中使用的患者数量显着变化，范围从6到4,263。将32个引用中的每个引用的人数相加得出的值为11,225。尽管LC-MS / MS是使用最广泛的蛋白质组学技术，但有几篇论文使用了更新的SOMAscan测定法。2D凝胶电泳也被一些研究小组采用，但是这种研究在较早的论文中更为常见，并且在2012年以后发表的论文中并未发现。其他技术，例如邻位延伸分析或SWATH-MS也被用于发现随着年龄的增长而发生显着变化蛋白质。
2. 两项或多项研究报到的多个蛋白质会随着年龄的增长而发生显着变化
在确定了要纳入我们系统综述的研究后，我们制作了一张包含报道每项研究均随年龄而发生显着变化的蛋白质表格。我们惊讶地发现，至少有两个或更多个不同的分析报告了1,128种蛋白质。虽然许多蛋白质是单个组织所特有的-例如IGFBP6和TNFRSF11B，但四项不同的研究均在血浆中报道了这两种蛋白质，并且两种蛋白质均随着年龄的增长而显着增加。例如，据报道，热休克蛋白HSPB1在骨骼肌，肝脏，结肠和皮肤中随年龄而变化。类似地，发现蛋白ANXA1在血浆，骨骼肌，唾液，皮肤和泪液中会随年龄而变化。在我们鉴定的1,128种常见蛋白质中，有两种（或两种以上）不同的组织和/或细胞类型报告了751种（66.58％）。在单个组织或细胞类型中，仅报道了377（约1/3）（33.42％）。
3.先前已报道许多常见蛋白质与衰老有关
这些常见蛋白质中有许多具有与衰老明显的联系。例如，蛋白APOE据报道总共3次，分别在血浆中、脑脊液中和血清中。荟萃分析已牢固地确定，APOE的遗传变异与人类寿命和晚期阿尔茨海默氏病有显着联系。另一个例子是GDF11，在两项不同的研究中，在血浆中GDF11随年龄而显着变化。在小鼠中，这种循环血液因子会随着年龄的增长而下降，并通过异时性共生被恢复，并且据报道，在外源性给予时，它会介导许多恢复活力的功能。尽管该蛋白值得进一步探索，但重要的是要注意GDF11的有益作用尚未得到一致报道。报告了IGF1两次，一次在血浆中，一次在脑脊液中。值得注意的是，抑制胰岛素-IGF1信号通路是最成熟且从进化的角度守恒的寿命延长策略之一。LMNA基因的突变会导致加速衰老疾病哈钦森-吉尔福德早衰综合症。LMNA的发现一次在骨骼肌中，一次在肝脏中。另一个例子是组蛋白脱乙酰基酶SIRT5，据报道在血浆中两次，在肝脏中一次。SIRT5是较大的NAD +依赖性去乙酰化酶家族的成员，该家族与动物模型的衰老和寿命密切相关。
4. 鉴定由五项或更多项研究报告的一小类随着年龄的增长而变化常见蛋白质
接下来，我们试图确定报道最多的随着年龄的增长而发生显着变化蛋白质。虽然两项或多项不同的研究报告了1,128个蛋白质，但我们发现三项或多项不同的研究报告了337种蛋白质，四项或多项不同的研究报告了117种蛋白质。只有32种蛋白质在五项不同的研究仅报道了，这使这些蛋白质成为我们系统综述中发现随年龄变化的最常见蛋白质。
5. 在五项或更多的研究中，所有发现随年龄变化的蛋白质都与衰老和/或与年龄有关的疾病有关
由于我们的1,128种常见蛋白质的较大列表包括已知的衰老调节因子，因此我们好奇这32种最常见的蛋白质是否与衰老和/或与年龄相关的疾病建立了联系。全面的文献检索表明，这些蛋白质中的每一个都具有这种联系。例如，人类GDF15的过度表达延长了小鼠的寿命和健康寿命。最近在小鼠中进行的研究表明，GDF15对于二甲双胍介导其对体重和能量平衡的有益作用是必需的。此外，二甲双胍可提高小鼠和人体内GDF15的循环水平。后者的发现具有重大意义，因为除了有效治疗人类糖尿病以及延长小鼠的寿命和健康寿命外，令人信服的临床数据还表明，服用二甲双胍的患者死亡率降低，各种与年龄有关的疾病的发生率也降低。最近的工作还发现，血浆蛋白GDF15，CTSS和THBS2的水平与老年人的行动能力障碍密切相关。这些数据以及我们的研究发现，血浆中的五项不同研究报告了GDF15随年龄的变化而显着变化，表明GDF15既是高置信度的衰老生物标志物，也是改善人类健康的可行治疗靶标。
尽管我们无法确定其他蛋白质中非疾病动物的寿命调节的已知联系，但我们能够发现与寿命，死亡率和/或年龄相关疾病的关联。在多物种筛选中发现与哺乳动物最高寿命相关的蛋白质，发现CAPNS1具有长寿特异性选择模式。还鉴定出COL3A1，在三项不同的蛋白质组学老化研究中，其报告随着年龄而变化。Mmp12是一种强大的衰老相关的分泌表型因子，其基因表达在小鼠的多个不同组织中随年龄增长而增加。随着年龄的增长，血浆中MMP12的表达也会增加。由于衰老生理变化是衰老的标志，而去除衰老细胞是提高小鼠寿命和健康期的既定方法，这是一个值得注意的联系。遗传上去除或抑制阿尔茨海默氏病小鼠模型中的C3会加剧神经退行性变，而缺乏Col18a1的小鼠会发生与年龄有关的视网膜变性。与仅缺乏Lmna的短寿命小鼠相比，另外缺乏Tmpo的小鼠受益于更长的寿命，体重增加，多能卫星细胞的更大增殖以及改善的肌生成。这很有趣，因为LMNA中的突变会导致著名的早老综合症。
6. 常见蛋白质的富集分析可确定随年龄变化的关键过程
接下来，我们对我们常见的蛋白质进行了生物信息学富集分析，以确定它们涉及哪些过程。对于在两项或更多项不同的研究中确定的1,128种常见蛋白质的列表，我们评估了KEGG（图1A），WikiPathways（图1B），Reactome（图1C）和GO BP（图1D）中最常见的十大途径。在我们的结果中免疫激活是一种最常见的途径。例如，WikiPathways（图1B），Reactome（图1C）和GO BP（图1D）中最富集的过程分别是“人类补体系统”，“中性粒细胞脱粒”和“粒细胞活化”。在KEGG数据库（图1A）中，第二富集的过程是“补体和凝血级联”。其他相关结果包括“细胞因子-细胞因子受体相互作用”（图1A），“沙门氏菌感染”（图1A），“补体和凝血级联反应”（图1B），“免疫系统中的细胞因子信号传导”（图2B）。 1C）和“白细胞迁移”（图1D）。还确定了与细胞外基质有关的几种结果。这些包括“局灶性粘附”（图1A），“局灶性粘附”（图1B），“局灶性粘附PI3K-Akt-mTOR信号通路”（图1B），“细胞外基质组织”（图1C），和“细胞外结构组织”（图1D）。“粘着点”是KEGG数据库中最高的结果（图1A），是WikiPathways数据库中第二丰富的结果（图1B）。一些与RNA调控有关的结果，即“mRNA加工”（图1B），“mRNA剪接-主要途径”（图1C）和“转录后基因表达的调控”（图1D）。胰岛素-IGF1和mTOR的经典衰老途径都涉及两个结果，分别是“局灶性粘附-PI3K-Akt-mTOR信号传导途径”（图1B）和“胰岛素样调节”胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）转运和摄取“生长因子（IGF）”（图1C）。还确定了与止血和血流有关的以下过程：“补体和凝血级联”（图1A），“补体和凝血级联”（图1B），“止血”（图1C）和“血管生成”（图1D）。
图1 显示了KEGG（A），WikiPathways（B），Reactome（C）和Gene Ontology Biology Process（GO BP）（D，E）的显著变化的相关蛋白通路
我们还分析了在32种最常见的蛋白质中富集的GO terms。过度表达分析表明，在32种最常见的蛋白质中与免疫激活，细胞外基质组织和血液循环相关的过程也存在过度表达（图1E）。由于该分析受到所涉及蛋白质数量的限制，因此我们使用基于网络拓扑的富集分析，通过BioGRID蛋白质-蛋白质相互作用网络将前50个网络添加到这32个最常见的蛋白质中。随后的GO富集分析（32种最常见的蛋白质加上50个网络）确定了排名前20位的GO富集项（图2A），并量化了每个富集的GO（图2B）。正如我们在对所有1,128种常见蛋白质（图1A–D）的分析中所见，与免疫信号有关的过程（“细胞对细胞因子刺激的反应”，“细胞因子的反应”）和细胞外基质（“细胞外结构组织”，“细胞外基质组织”）再次出现（图2）。然后对所有常见蛋白质（图3A）以及我们最常见的蛋白质（图3B）进行GLAD4U药物富集分析，以根据提供的蛋白质靶标确定要富集哪些药物。在两次或更多次不同的分析中发现的1,128种蛋白质会随着年龄而变化，最高的药物富集结果是“碳水化合物”，“心血管系统”，“胰蛋白酶”，“奈替米星”，“蛋白水解酶”，“骨架”，“免疫球蛋白”，“妥布霉素”，“氨基酸”和“ l-赖氨酸”（图3A）。
图2 所示网络拓扑富集分析用于扩展32个最常见的老化蛋白的网络，使用蛋白质-蛋白质相互作用，并捕捉前50个相邻蛋白
最后，我们利用GLAD4U疾病富集分析来确定可能在至少两次（图3C）或五次（图3D）研究中鉴定的蛋白质中富集的疾病。在两项或多项研究中发现的与年龄相关的蛋白质中，最丰富的疾病是“粘着”，“炎症”，“心血管”疾病，“药物与药物的相互作用”，“妊娠并发症”，“纤维化”，“病理过程”，“压力”，“肿瘤过程”和“关节疾病”（图3C）。当只关注五项或更多项研究中鉴定出的与年龄相关的蛋白质时，鉴定出一组不同的疾病。这些是“排尿障碍”，“肿瘤侵袭性”，“血管新生，病理性”，“冠状动脉疾病”，“胸腔积液”，“血液系统疾病”，“皮肤和结缔组织疾病”，“肝硬化”和“皮脂溢” NOS”（图3D）。这些结果进一步验证了炎症和衰老的联系。而且，它们突出显示了多种不同的与年龄有关的疾病，包括癌症，关节炎和心脏病。
图3 所示对所有32种蛋白进行了GLAD4U药物富集分析
7. 推荐血浆蛋白检测板用于人类衰老生物标记
理想的蛋白质组学衰老生物标记物应该是容易测量，只需要极少的蛋白质，并且能够反映衰老的加速或减速。鉴于血液是临床生物标记的极具吸引力的生物流体，并且血浆是我们系统综述中最常见的组织，因此我们整理了23种蛋白质的列表，据报道这些蛋白质会随着四个或更多不同的研究显示血浆中的衰老。
为了部分验证该数据集，我们利用了Lehallier等人开发的新构建的在线蛋白质组学和老化资源。该资源允许用户输入蛋白质，并观察其血浆蛋白质组中的蛋白质如何随着年龄的变化而变化，这些数据来自4,000多名成人患者。利用此在线界面，我们可以观察随着年龄增长的表达趋势，并确定我们建议的面板中蛋白质的重要性。我们发现，所有鉴定出的蛋白质的p值均小于0.05。除了p值为0.063241581的HGF外，所有蛋白质的p值均<0.05。p值随年龄变化最明显的四种蛋白质是GDF15，PTN，MMP12和NPPB。这四种蛋白质的表达随时间变化如图4所示。其他蛋白质的如图5所示。令人惊讶的是，所有这些蛋白质都有随着年龄增长而表达增加的趋势。
图4 所示GDF15 (A)、PTN (B)、MMP12 (C)和NPPB (D)随年龄增长的表达趋势
图5 所示在我们提出的蛋白质组老化时钟中，显示了其余蛋白质(不包括GDF15、PTN、MMP12和NPPB，如图4所示)随年龄增长的表达趋势，该时钟由四项或更多不同研究中报道的血浆中随年龄变化的蛋白质组成
尽管这些数据表明，这23种蛋白质足以进行衰老生物标记，但包含其他血浆蛋白可能会使衰老时钟更可信。考虑到这一点，我们扩大了研究范围，在三项或更多不同的研究中报道了85种蛋白质，这些蛋白质据报道随着血浆的年龄而显着变化。然后我们使用Lehallier等人开发的在线蛋白质组学和老化资源分析了这些蛋白质。这些蛋白中的两种-CST3和EFEMP1-无法测量，因此我们无法提供它们的统计信息。补充表6提供了更多的529种蛋白质的清单，这些蛋白质据另外两项不同的研究报告随血浆的年龄而变化。
8. 新型蛋白质组老化时钟可准确预测大型患者队列中的患者年龄
提出了两个版本的新型蛋白质组学老化时钟后，我们很好奇这个时钟是否可以准确预测大型患者队列中的患者年龄。因此，我们直接评估了由3,301名年龄在18-76岁之间的人类受试者组成的INTERVAL队列的蛋白质组时钟的能力。在这个庞大的蛋白质组学数据集中，对四个或更多不同研究报告的所有23种蛋白质均随血浆年龄的变化进行了测量。对于由三项或更多项不同研究报告的随年龄变化的85种蛋白质组成的扩展面板，测量了83种蛋白质。
我们生成学习（n = 2,178）和测试（n = 1,123）数据集，并使用Pearson和Spearman相关性以及通过计算平均绝对年龄来评估预测准确性。对于四项或更多项不同研究涉及的23种血浆蛋白，学习集的皮尔逊相关系数为0.71，斯皮尔曼相关系数为0.71，平均年龄为8.17岁（图6A）。测试集的皮尔逊相关系数为0.66，斯皮尔曼相关系数为0.69，平均三角洲年龄为8.54岁（图6B）。扩大的蛋白质组的结果令人印象深刻。对于学习集（图6C），我们计算出Pearson相关系数为0.9，Spearman相关系数为0.91，平均三角洲年龄为4.88岁。对于测试集，皮尔逊相关系数为0.87，斯皮尔曼相关系数为0.88，平均年龄为5.5岁（图6D）。因此，该蛋白质组老化时钟的缩短和扩展版本均能够预测人类年龄。扩展的蛋白质面板特别坚固。
图6 所示利用由年龄在18-76岁的3301名受试者组成的间隔队列，我们评估了我们的血浆蛋白组老化时钟预测人类年龄的能力
讨论
在这项系统的综述中，我们整理并分析了评估人类衰老中蛋白质组学变化的多项不同研究。除了鉴定随人类年龄变化的常见蛋白质外，我们还发现了许多蛋白质，它们是抗衰老疗法和衰老生物标记的可靠候选者。我们还利用生物信息学分析来了解我们的常见衰老蛋白涉及哪些途径和过程。最后，我们提出并充分验证了一种新颖，强大的蛋白质组学老化时钟。
关于时钟的老化，我们鉴定了在血浆中表达的大量常见蛋白质，并提出了两种可用于预测生物学年龄的蛋白质面板。第一个较小的面板包括在四个或更多研究中随年龄显着变化的蛋白质，而较大的扩展面板包括在三个或三个以上研究中随年龄显着变化的蛋白质。除了使用来自4,000多个患者的公开蛋白质组学数据验证这些检测组中的单个蛋白质之外，我们还证明这些蛋白质检测组是真正的衰老时钟，可以准确预测大型患者队列中的患者年龄由3,301名受试者组成。在此数据集中，存在具有预测年龄的好奇离群值，这些年龄明显偏离其年代年龄。与使用由甲基化DNA组成的老化时钟已经完成的工作类似，确定预期年龄比其年龄年龄低的患者通常是否更健康会很有趣。同样，确定预期年龄比其年龄年龄高的患者是否更可能患有与年龄有关的疾病将是无价的。由于血浆蛋白谱与不同的健康状况，生活方式和疾病风险相对应，因此未来的研究应寻求优化该蛋白钟，以增强其预测年龄和衡量患者健康的能力。可以通过挖掘我们的529种蛋白质的清单来创建量身定制的老化时钟，这些蛋白质被两项或多项不同的研究报告为随着血浆中的年龄而变化。
尽管这项研究提供了有关衰老的独特见解，但确实有局限性。最大的局限性在于系统评价包括32种不同的研究，这些研究利用了几种不同的技术来测量蛋白质。这些技术中的每一种仅分析一定数量的蛋白质，因此，并非每项研究都检测到了我们鉴定出的所有常见蛋白质。确实，有些研究没有测量此评价中包括的绝大多数蛋白质。因此，这会引入一种偏见，这种偏见可能导致人为报告某些蛋白质的频率要高于每项研究测量同一组蛋白质的频率。因此，由于所纳入研究的测量偏倚，有可能忽略了一些重要的蛋白质，而一些不太重要的蛋白质被过度报道。然而，即使有这种偏见，我们仍然发现，我们最常报道的许多蛋白质都是已知的衰老和/或寿命调节剂。此外，我们最常用的血浆蛋白能够预测来自大型人群的血浆蛋白质组中的患者年龄。因此，本系统综述中采取的方法能够成功鉴定出大量与衰老有关的蛋白质。
来自不同生物流体和流体的结果的汇总提出了另一个限制。由于LC-MS / MS受检测限的限制，血浆中蛋白质的动态范围非常大，因此，这不是用于血浆的最佳技术。为了避免这种局限性，理想地，应使用相同的蛋白质组学技术来测量不同生物流体和组织中的同一组蛋白质。从这里开始，机器学习，富集分析和表达比较可用于识别组织特异性衰老时钟，途径变化和蛋白质变化。取而代之的是，可以生成一个模型以更好地了解蛋白质组学方法与组织或生物流体如何相互作用以影响最终鉴定出哪些与年龄相关的蛋白质。尽管目前的研究中并未考虑到这一点，但仍需进一步努力以更好地理解这些参数之间的相互作用。
结论
总之，我们的发现为人们随着年龄的增长而变化的过程提供了新颖的见解，为抗衰老干预措施提出了新的靶标，并揭示了一种新型的蛋白质组学老化时钟。这些数据应在以后的研究中加以利用，以帮助开发可显着延长人类健康寿命的临床疗法。通过提高患者的生活质量并减轻医疗费用的主要来源，该目标的实现将具有很大的变革性。