科研 | Molecular Plant：利用自然变异来确定番茄中果多酚的通路结构和代谢调节
编译：太阳味的风，编辑：Emma、江舜尧。
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虽然植物初级代谢途径的结构在品种间通常是很明确且高度保守的，但是那些定义特殊代谢的结构在不同品种之间没有明显的特征或更多的变化。在这项研究中，我们通过表征构成八种不同番茄多酚代谢网络的潜在生物合成和修饰反应，研究了多酚类物质在番茄系（lycopersicum complex）中的代谢。为实现这一目的，我们基于GC-MS和LC-MS的代谢组学对番茄和野生番茄的不同组织进行了研究，并对MapMan转录组的杂交微阵列数据和生物合成基因注释的公开可用RNA测序数据进行了评估。综合数据用于编制多酚代谢的品种特异性代谢网络，从而建立了一个完整的泛品种生物合成框架，并解释了在脂肪酸代谢多样性形成过程中所涉及的修饰酶的功能。结合目前对番茄脂肪醇生物合成的理解以及对果实成熟过程中代谢变化的全球观点，对综合结果进行了讨论。我们的研究结果提供了一个例子，即说明如何使用大规模生物学方法来定义和确定大型特异性代谢途径。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 番茄组织中多酚代谢的模型
作为了解整个番茄多酚代谢框架的第一步，我们进行了核磁共振研究，或用液相色谱-质谱（LC-MS）中的标准化合物来确定番茄多酚。为了评估各代谢物类别的组织特异性，我们使用超高效液相色谱-傅立叶变换质谱（UPLC-FTMS）对番茄培育品种S. lycopersicum（LYCO）（M82）未成熟果实、成熟果实、叶子、茎和根的提取物进行了特殊的代谢物分析。
除根外，所有组织中均检测到高水平的黄酮醇三甘糖苷，但仅在果皮、叶和茎中检测到高水平的黄酮醇甘油三苷。查尔酮只在果皮提取物和成熟水果中检测到（图1B）。此外，尽管mono-CGA（CGA， chlorogenic acid 绿原酸）在果实组织中的积累量很高，但di-和tri-CGA仅在成熟水果组织中观察到。在所有组织中均观察到羟基肉桂酸衍生物（图1C）。这些已知多酚化合物的组织特异性随后被用于分析番茄材料的自然变异，并重建番茄系的多酚生物合成框架。
图1.M82中主要特殊代谢物的结构特异性
（A）番茄主要多酚类次生代谢产物。（B）LC-MS分析番茄组织中特殊代谢物含量的热图显示。分析采用三个独立的生物复制品进行。相对峰值区域由红色（高）到白色（低）的颜色梯度显示。（C）番茄多酚代谢物的已知生物合成框架。
2. 影响番茄果实成熟的代谢组学特征
为了全面了解番茄多酚的生物合成框架，我们选择了七种主要的番茄品种（S.pimpinellifolium， PIMP；S.cheesmaniae， CHEE；S.chmielewskii， CHMI；S.neorickii， NEOR；S. peruvianum， PERU；S. habrochaites， HABR；and S. pennellii， PENN）（图2A）。尽管几种苯丙酸类代谢物主要是果皮特有的（图2B），但我们使用整个果实进行代谢组学分析，试图了解果实成熟过程中发生的代谢变化。
与已知的番茄品种（如LYCO和PIMP）的代谢变化（其成熟在代谢水平上具有相对良好的特征）相比，在不同品种的果实成熟过程中观察到不同的代谢变化（图2C）。有趣的是，b-丙氨酸和g-氨基丁酸在成熟过程中仅在LYCO、PIMP、CHEE、CHMI和NEOR中观察到减少，而苏氨酸、谷氨酰胺和支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的损失在所有番茄材料中都观察到。
此外，所有绿果种的丝氨酸和甘油酸水平呈负相关，而奎尼酸在CHMI成熟果实中积累到显著的高水平。与观察到的含有红色/黄色类胡萝卜素的水果中苹果酸的减少相反，绿果种（如CHMI，HABR）在果实成熟过程中类似有机酸显著增加。苯丙氨酸是酚类代谢物的前体，除苯丙氨酸外，其他品种的苯丙氨酸含量都有所下降。
利用从不同番茄品种的叶片、未成熟果实和成熟果实中获得的代谢物，使用HCA（hierarchical clustering analysi 层次聚类分析）对单个多酚类的组织特异性和种间多样性进行了评估（图3）。HCA的代谢物聚集导致化合物族间的明显分离，根据其品种和组织特定的积累模式推测的苯酰基黄酮、羟基肉桂酸盐、氯仿相关化合物和二苯乙烯类化合物（图3）。
图2.不同番茄品种果实成熟的代谢组学特征
（A）本研究所用番茄品种及其来源。1，M82（S.lycopersicum）；2，PIMP（S.Pimpinellium）；3，CHEE（S.cheesmaniae）；4，CHMI（S.chmielewskii）；5，NEOR（S.neorickii）；6，PERU（S.peruyianum）；7，HABR（S.habrochaites）；8，PENN（S.Pennelli）。（B）GC-MS分析不同番茄品种未成熟和成熟果实初级代谢产物的差异。（C）果实成熟过程中主要初级代谢产物的变化。白色和黑色分别代表成熟和不成熟的果实。
图3.利用LC-MS对番茄品种的叶片、未成熟果实和成熟果实进行代谢组学分析
用三个独立的生物学重复的平均值进行分析。
3. 多酚代谢品种特异性代谢多态性分析
利用不同组织和/或品种之间的代谢丰度和68种已识别/推测注释的化合物的结构，我们能够对番茄体系中多酚代谢的生物合成框架进行全面概述。图4总结了最终确定的路径。将含有图4和图1C的网络进行比较，可以看出这种方法在弥补植物特殊代谢途径中的作用。
图4.番茄多酚生物合成框架的概述
4. 从代谢组学数据预测基因表达
为了确定是否能够准确地预测所述生物合成框架中涉及的基因表达水平，我们首先比较了每种组织和品种中与目标酶基因相关的每种代谢物的总量。
在这一步之后，我们根据是否存在所积累的代谢物，预测了编码反式脂肪醇修饰酶基因（图5A和5B）的转录组质量差异。尽管这种方法容易受到转录物和代谢物数量之间的潜在差异影响，但它可以初步了解某个基因在品种或组织中是否活跃。
我们的研究结果表明，在HABR的果实和叶片中，一些中间产物（左旋-3-O-葡萄糖苷衍生物）积累到较高水平，表明编码糖基转移酶（UGT）的基因表达可忽略不计（图5B）。此外，CHMI和NEOR在果实和叶片中未发现FLIFAVOL-3Glc2’’Api的积累，这表明这两个物种都没有或缺乏编码F3G2’’ApiT的基因表达。
图5.提出了与注释生物合成框架有关的基因的相对表达模式
（A）根据代谢组学数据估计基因的相对表达水平。（B）不同番茄品种类黄酮修饰步骤中代谢产物流的示意图。灰色和黑色分别表示未成熟和成熟果实中的代谢物水平。
5. 类黄酮生物合成相关基因的跨物种注释
接下来，我们进行了基于基因组的同源基因搜索，以便将编码已知酶的基因筛选到我们确定的多酚途径中。通过将代谢产物结构与酶活性相匹配，共注释了26个与类黄酮生物合成有关的酶基因。
表1中带星号的基因是众所周知的或经过实验鉴定的基因，它们参与番茄的苯丙素和类黄酮生物合成。在我们的调查中，有10个基因，分别是SlCHS1（TCHS1，CAA38980），SlCHS2（TCHS2，CAA38981），SlDFR， FOMT1和FOMT2，ScAN1，AnthOMT，SlCGT和SlFdAT1被发现在番茄品种中被实验性地描述为类黄酮酶基因。在包括拟南芥在内的许多双子叶植物中，编码苯丙酸生物合成常见酶（如PAL、C4H、4CL、CHI和F3H）的基因也基于序列相似性进行了注释（表1）。结合这些方法，我们注释了19个已知基因和另外7个推测参与番茄类黄酮生物合成途径的关键基因。七个关键基因（CDRB、P3050CGT、OMT1、Fd3GlcT、F3G200ApiT、Fd3G600RhaT和f7glct）最初被认为与多酚途径有关，但现在已经作为其他已知基因的同源基因，将其作为催化其他植物品种酶促反应的同源基因，被放在类黄酮生物合成途径中。
表1.番茄次生代谢相关基因注释
*以前有特征或注释过的基因。
6. 整合基因组学和转录组数据
我们调查了番茄品种的公开可用RNA序列数据，并将其与我们的代谢数据交叉引用，以预测番茄的转录活性（代谢）基因。图6A显示了四种番茄（LYCO、PIMP、HABR和PENN）叶片中类黄酮生物合成基因的表达分析。我们首先通过跨品种代谢组学分析，用预测的基因表达模式来评估转录表达数据。F3’H是参与山奈酚或槲皮素产生的关键酶基因，与LYCO、PIMP和HABR相比，PENN的F3’H积累水平更高。虽然我们观察到硅内转录组数据和我们的预测之间的差异表达程度不同，但总体而言，结果表明，当代谢产物表现出不同的代谢表型时，可用于预测综合代谢网络中的基因表达。
图6.番茄类黄酮生物合成途径中UGT功能基因的预测
（A）共同类黄酮生物合成基因的表达分析。（B）番茄UGT基因氨基酸序列的分子系统发育树（C） LYCO、PIMP、NEOR、HABR和PENN的UGT-PSPG序列比较。（D）重组蛋白Solyc10g083440的检测。（E）过量表达转基因拟南芥的Solyc10g083440中的黄酮苷的产出。分析使用了三到六个生物复制品。误差线表示SE。红色和蓝色分别表示增加和减少。
7. 番茄类黄酮糖基转移酶候选基因的功能验证
我们选择使用基于转化（transformation，遗传学）的方法来确认UGTs的活动。为了验证被注释为氟醇糖基转移酶的候选基因的功能，我们从LYCO中克隆了SlSolyc10g083440基因（SlUGT78D1-a，注释为3-O-葡萄糖基转移酶）。此外，利用SlUGT78D1-a（从LYCO、PIMP、NEOR、HABR和PENN获得的基因）对番茄品种间的遗传多态性进行了研究（图6C）。
slatt78d1-a的功能通过评估拟南芥和番茄过度表达系或番茄病毒诱导的基因沉默（VIGS）系的代谢产物来验证。首先，与野生型和拟南芥AtF3GlcT基因敲除突变株（At5g17050，AtUGT78D2）相比，过量表达SlUGT78D1-a的拟南芥植物表现出更高的flavool-3Glc累积量（图6D）。
接下来，在未成熟的果实中进行农业注射基因沉默病毒后，成熟果实在破碎期后10天收获。采用液相色谱-质谱（LC-MS）分析了果皮甲醇提取物中黄酮醇的含量，flavool-3-Oglucosides的水平明显降低。
结论
综上所述，我们在这里阐明了八种番茄多酚生物合成的整体生物合成框架，并对代谢物和结构基因进行了详细的注释。考虑到番茄品种中多酚类化合物的巨大化学多样性，以及它们的多重生理作用，这些结果将有助于代谢组学辅助育种、RNA测序和遗传多态性分析。此外，番茄果实成熟过程中的代谢变化也是未来基因代谢工程设计的关键目标之一。