科研 | Science：蛋白酶体控制古生菌中ESCRT-III介导的细胞分裂研究
编译：东方不赢，编辑：Emma、江舜尧。
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细胞周期是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后生长，再到下一次分裂结束的循环过程。细胞周期的长短反映了细胞所处状态。癌变的细胞以及特定阶段的胚胎细胞常常有异常的分裂周期。细胞周期长短是如何进行调节的至今未得到完整揭示。嗜酸硫杆菌（Sulfolobus acidocaldarius）是真核生物在实验上最易处理的古细菌近亲，尽管缺乏明显的细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白同源物，但其拥有有序的类真核生物细胞周期，因此可以作为细胞周期研究的进化模型。在本研究中，研究者通过流式细胞仪，超高分辨率显微镜，以及蛋白质结晶方法揭示了蛋白酶体在驱动复合ESCRT-III共聚物的结构变化中的作用，从而使基于ESCRT-III的分隔环能够逐步组装，拆卸和收缩。此研究指出了蛋白酶体在真核和古细菌细胞周期控制中的保守作用，为真核细胞周期起源于古细菌提供了更多证据。
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实验设计
1.培养及同步化：嗜酸硫杆菌通过乙酸处理和蛋白酶体抑制实现同步化。通过蛋白质印迹和质谱对提取的蛋白质进行生化分析，并通过qPCR进行生化分析。
2.生化分析与质谱分析：在含GFP报告基因的有活性和无活性蛋白酶体装配的条件下进行蛋白酶体活性的体外测定。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和全蛋白质印迹法测试了对抗体特异性。
3.嗜酸链球菌遗传学：经过阿拉伯糖诱导产生了两种过表达菌株：（i）显性阴性和（ii）野生型。两种菌株表达蛋白质互补于菌株尿嘧啶营养缺陷型的质粒上。
4.显微镜和流式细胞分析：对DNA和S层以及抗ESCRT-III同源物的抗体染色进行显微镜观察和流式细胞仪分析。无活性的蛋白酶体亚基在大肠杆菌中过表达后进行纯化。
5.分子动力学模拟：将由48,000个颗粒组成的流体球形膜与由三联珠亚基建模的手性ESCRT-III丝状体一起建模。对ESCRT-III丝状体的收缩和分解模拟使用LAMMPS分子动力学软件。
实验结果
1. 硼替佐米可抑制嗜酸链球菌蛋白酶体活性
研究团队通过共表达出小亚基构建一个3.7Å蛋白酶结构衍射晶体（图1A）。然后使用来自古细菌和酿酒酵母的等效复合物的结构构建一个有催化活性的同源性模型。在酸链球菌蛋白酶体的结构中代替了一个无活性的β亚基，将硼替佐米（广古菌和真核生物的蛋白酶抑制剂）放在模型的活性位点，硼替佐米的硼酸部分与活性位点苏氨酸的亲核羟基形成键，表明该小分子可能够抑制嗜酸链球菌蛋白酶体的蛋白水解活性。
为确定硼替佐米是否能在体外抑制嗜酸链球菌蛋白酶体，研究者进行活性复合物降解绿色荧光蛋白（GFP）底物降解速率测试。当用不同浓度的抑制剂进行该测定时，底物降解的速率降低了（图1C）。之后通过突变了一个保守的缬氨酸残基（介导活性位点，抑制剂和苏氨酸的关键性），导致纯化的嗜酸链球菌20S蛋白酶体对硼替佐米的敏感性降低，从而验证了抑制剂的作用位点和结合方式。
2. 蛋白酶体抑制阻滞嗜酸链球菌的细胞周期
研究者将硼替佐米添加到嗜酸链球菌培养物中以寻找20S蛋白酶体在细胞周期控制中的可能作用。使用乙酸使细胞同步至G2期，并在重新进入细胞周期并分裂时通过流式细胞术进行观察。当硼替佐米添加到培养物中从乙酸中止释放后80分钟时，细胞无法分裂（图1D）。此外，硼替佐米诱导的细胞周期停滞伴随着携带核苷的细胞数量的两倍增加。
研究者用了表达胸苷激酶（STK）的嗜酸链球菌突变菌株，大多数同步化的STK细胞进入S期时会将胸苷类似物EdU分裂并掺入其DNA中。相比之下，在分裂前用硼替佐米处理的细胞中没有EdU掺入，因此没有DNA合成（图1，G和H）。但是，当在后期将硼替佐米添加到同步培养物中以抑制新分裂细胞中的蛋白酶体时，这些G1细胞继续不受阻碍地进入S期和G2（图S4E）。这些数据表明，抑制蛋白酶体的活性可以特异性地阻止细胞分裂，也可以直接或间接地阻止下一轮DNA复制。
图1 抑制蛋白酶体后，S.acidocaldarius细胞分裂停止
（A）嗜酸链球菌28亚基Saci_0613 /Saci_0662ΔN20S蛋白酶体组件的侧视图。Saci_0613α亚基由蓝色和紫色调表示。Saci_0662ΔNβ亚基由红色，粉红色和米色表示。（B）使用CovDock软件将可逆抑制剂硼替佐米与酸性链球菌20S蛋白酶体中的活性β亚基（Saci_0909ΔN）糜蛋白酶位点的模型结合。催化苏氨酸（Thr1）显示为共价键与硼替佐米分子的硼酸基团结合的红棒。参与催化的Asp17，Lys33，Ser129，Asp166和Thr169显示为黄色棒状。带有保守残基Ala20，Ser21和Gly47至Val49的两个环（蓝色）介导了抑制剂的结合。（C）通过Saci_0613 /Saci_0662ΔN/Saci_0909ΔN20S蛋白酶体对GFP对照或Urm1（x3）-GFP底物进行的定量降解测定。误差线代表平均值±SD（来自N = 3）。数据采用Welch t检验进行分析；** p = 0.0034。（D）流式细胞术直方图，显示释放后80分钟（分裂前）用硼替佐米或DMSO处理的不同步步和同步群体中细胞中的1N和2N DNA信号。N = 3，n =105。T，释放后的时间。（E）从乙酸中释放后，用DMSO或硼替佐米处理40分钟，80分钟的同步细胞的宽视野显微镜图像。固定的细胞用Hoechst染色以显现DNA，而刀豆球蛋白A则标记S层。红色箭头表示具有分离的类核苷酸的细胞。显示了代表性图像。比例尺1μm。（F）在用DMSO或硼替佐米处理后，同步化种群中具有分离的类核苷酸的细胞百分比的定量分析。误差线代表平均值±标准差，取自N = 3和n = 100。** p = 0.0069。（G）从乙酸中释放100分钟后，用DMSO或硼替佐米处理40分钟的同步STK细胞的广域显微图像。用Hoechst对细胞进行染色以使DNA可视化，而伴刀豆球蛋白A对S层进行可视化，并使用点击化学法对EdU进行可视化。红色箭头表示将EdU掺入新合成的DNA中的细胞。比例尺1μm。（H）DMSO或硼替佐米处理后，掺入EdU的同步细胞的百分比定量。误差线代表SD，N = 3和n = 106的平均值。
3. 在细胞分裂过程中蛋白酶体靶向结合CdvB
观察到蛋白酶体抑制后的细胞周期停滞，研究者使用串联质谱标签（TMT）标记和定量质谱法鉴定在细胞分裂中蛋白酶体介导的目标蛋白。通过比较经硼替佐米处理的同步培养物的蛋白质组含分裂前被阻滞的细胞与抑制剂洗脱后培养物的蛋白质组，从捕获物中释放后下降最多的蛋白质浓度为ESCRT-III同源物，CdvB。另外，当将MG132处理的预培养培养物的蛋白质组与DMSO处理的对照的蛋白质组进行比较时，CdvB降低幅度很高。此外，在诱导表达Walker B显性阴性PAN AAA + ATPase（可封闭20S蛋白酶体的蛋白质）后，细胞中的CdvB水平显着增加（图2C）。CdvB是在这些实验中始终富集的唯一分裂蛋白（图2A）。
图2 在细胞分裂过程中蛋白酶体靶向结合CdvB
（A）用硼替佐米处理40分钟的预同步细胞中的蛋白质组变化，与硼替佐米被洗掉后（分裂后）15分钟后的蛋白质组变化，两个独立重复相关性质谱散点图。排名前五位的歌曲均以绿色显示（除了CdvB以外）。（B）同步细胞的CdvB和Alba（对照）的Western印迹，从乙酸中释放80分钟后，用DMSO/MG132/硼替佐米处理40分钟或未处理。（C）（左）比较PAN-WkB-HA显性负过表达菌株在未诱导和诱导条件下的CdvB信号流式细胞术直方图（右）Western印迹显示PAN-WkB-HA和CdvB蛋白水平的变化。（D和E）在不同步培养中细胞与CdvB（D）和CdvB1（E）蛋白信号的流式细胞仪散点图。红色框分别突出显示（D）和（E）中具有高CdvB和CdvB1信号的“有丝分裂”细胞。每个蓝色斑点代表一个单元，密度梯度从蓝色（低）变为红色（高）。N = 3，n =106。（F）不同步培养的CdvB与CdvB1信号的流式细胞仪散点图，显示了蛋白质的交替积累和减少。N = 3，n =106。（G）（F）所示框中的细胞DNA分布的流式细胞术直方图，显示从2N到1N的转变仅在CdvB完全降解后发生。（H和I）用硼替佐米处理的不同步培养的DNA与CdvB和CdvB1信号的流式细胞仪散点图。N = 3，n =106。（J）在用硼替佐米处理的不同步培养物中，CdvB与CdvB1该散点图显示了表达CdvB和CdvB1的细胞积累，且CdvB水平选择性升高。N = 3，n =106。（K）有丝分裂种群中CdvB，CdvB1和CdvB2信号的中位数定量。双尾t检验分析数据。* p = 0.0245。误差棒代表平均值±SD，取自N = 3 ns。
当他们使用流式细胞仪评估未分裂的细胞分裂时，不同的ESCRT-III蛋白的水平时，他们观察到了CdvB蛋白突然从细胞中减少的现象。同样，发现CdvB在分裂前细胞中积累高水平，但在新分裂的G1细胞中却不存在（图2D）。相比之下，CdvB1和CdvB2在整个分裂过程中均保持较高水平，在新分裂的子细胞之间含量可区分（图2E），CdvB在具有2N DNA含量的细胞中，即在细胞分裂之前被降解了（图2F和G）。如上述所说，对CdvB的流式细胞仪分析表明，被硼替佐米分裂之前被阻滞的细胞水平增加（图2H），而CdvB1和CdvB2的中位水平保持不变（图2I至K）。
4. CdvB降解会触发CdvB1：CdvB2环的收缩
研究者使用超分辨率径向波动（SRRF）显微镜对不同阶段的古生ESCRT-III分割环成像。这揭示了ESCRT-III分隔环的三个不同类别：（i）缺少CdvB1的CdvB环，（ii）具有共定位的CdvB和CdvB1的环，以及（iii）缺少CdvB的CdvB1环（图3A）。明显地，具有CdvB1环但缺乏CdvB信号的细胞是唯一处于收缩状态的细胞。这些数据体现了从预组装的CdvB：CdvB1环选择性蛋白酶体介导的CdvB降解作用。这与CdvB环的平均直径为1.23μm（n = 496，SD = 0.15）（图3B）和CdvB共同染色的CdvB1环的几乎相同的平均直径为1.24μm（n = 285，SD = 0.17），而缺少CdvB的CdvB1环往往大小可变且较小（平均值= 0.62μm，n = 61，SD = 0.35）（图3C）。此外， CdvB1环的直径与分隔颈部的直径几乎完美相关（图S8G）。最后，在所有图像中CdvB1和CdvB2环的直径几乎完美相关，这表明两个ESCRT-III同源物在分割过程的环收缩阶段协同工作[N = 399，相关系数（r）= 0.98，p = 2.2×10-16]（图S8H）。综上所述，这些数据表明，收缩是由蛋白酶体选择性和快速降解CdvB引发的。按照这种想法，在用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理后，研究者无法在细胞中检测到缺少CdvB的CdvB1环（或缺少CdvB的CdvB2环）。此外，经硼替佐米处理的细胞中所有环的平均直径均等于跨细胞最长轴的CdvB环的均匀宽度，突显了蛋白酶体介导的CdvB降解在触发细胞收缩中的作用（平均值= 1.23μm，N ＝ 346，SD ＝ 0.32）（图3D）。在用蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理后，研究者无法在细胞中检测到缺少CdvB的CdvB1环（或缺少CdvB的CdvB2环）。此外，经硼替佐米处理的细胞中所有环的平均直径均等于跨细胞最长轴的CdvB环的平均宽度，突显了蛋白酶体介导的CdvB降解在触发细胞收缩中的作用（图3D）。
图3 CdvB的有针对性的降解触发CdvB1的收缩
（A）在指数增长的不同步细胞培养物中观察到的环状结构的代表性SRRF超分辨率图像。用Hoechst（蓝色），CdvB（紫色）和CdvB1（绿色）对细胞进行DNA染色。复合图像下方的图像代表CdvB（左）和CdvB1（右）通道。百分比是指总有环结构比例。比例尺=0.5μm。（B）在不同步培养中定量CdvB和CdvB1环的直径。X=平均环直径。（C）在有无CdvB环的情况下对CdvB和CdvB1的环直径的定量，显示了失去CdvB如何导致CdvB1的收缩。（D）在存在蛋白酶体抑制剂硼替佐米的情况下定量CdvB和CdvB1的环直径。（B）至（D）中的数据均来自六个以上的图片和三个生物学重复。红色条代表平均值。
图4 古细菌中ESCRT-III介导的细胞分裂的物理模型
（A）从线性iSIM显微镜数据集中相对于CdvB1环直径绘制的细胞质CdvB1信号的定量，线性回归具有95％的置信区间，以黑色显示。插图显示了收缩后各个阶段CdvB1和分裂后G1细胞的代表性线性iSIM显微图像。比例尺=1μm。（B）ESCRT-III丝状体的分子动力学模拟是由三联珠单元构建的，这些子单元通过谐波弹簧连接形成螺旋。建模的细胞膜仅吸引绿色珠子。螺旋经历几何形状的变化，从具有与CdvB的CdvB1相对应的低曲率1 / R0到与没有CdvB的CdvB1相对应的大曲率1 / Rtarget的状态。这种变化发生在CdvB的蛋白酶体降解之后。（C）作为时间函数的模拟快照，表明不能仅通过收缩ESCRT-III丝状体来实现细胞分裂；参见电影1。（D）仿真快照显示，ESCRT-III丝状体的拆卸对于细胞分裂是必要的。
5. 古细菌中ESCRT-III介导的细胞分裂的分子动力学模型
为了在分裂过程的最后阶段更好地监控CdvB1环的水平和位置变化，研究团队使用线性结构化照明显微镜（iSIM）对细胞进行了成像，结果表明CdvB1分隔环的收缩既伴随着颈部荧光信号强度的增加，也伴随着弥散细胞质信号水平的增加（图4A）。在整个过程中，CdvB1的总强度保持恒定。结果新分裂的细胞具有很多的弥漫性CdvB1，与流式细胞仪数据一致（图2F）。在这些早期G1细胞中不存在大的聚合CdvB1：CdvB2结构，这意味着如果没有CdvB模板，CdvB1和CdvB2不会形成的ESCRT-III丝状体。与该结论一致的是，当CdvB2在异位表达于被乙酸阻滞在G2中的细胞中时，它会扩散。综上所述，这些观察结果表明分裂机制遵循固定的顺序：1）CdvB形成ESCRT-III环，2）将CdvB1：CdvB2环的组装作为模板，3） CdvB1：CdvB2环在CdvB突然去除和降解后会收缩，4）在分裂过程中分解。
为了测试这些发现是否为酸性嗜盐链球菌的细胞分裂提供了合理的物理机制，研究团队基于最近开发的ESCRT物理模型，将这些数据用作ESCRT-III介导的细胞分裂的粗粒分子动力学模型的构建。在这些模拟中，代表分裂环的建模丝状体通过其膜结合界面与三维模型的细胞质膜结合。为了模拟分割过程，他们定义了两个不同的首选丝状体构象：低曲率的CdvB1（CdvB +）状态（由较大的首选半径R0决定）和高曲率的CdvB1（CdvB-）状态（由较小的目标半径决定）（图4B）。在此模型中，初始CdvB1（CdvB +）状态和CdvB1（CdvB-）状态之间的过渡代表CdvB的快速损失。尽管在这些模拟中CdvB1 ESCRT-III丝状体的收缩能够迅速减小细胞周长，但由于颈部空间位阻，它不足以诱导分裂（图4C和电影1）。因此，如在细胞中观察到的那样，只有当CdvB1丝状体收缩时才允许分解（图4A），才发生分裂（图4D）。这被建模为单个子单元以特定速率从螺旋的两端逐渐丢失，从而使丝状体长度随时间线性减小。总而言之，这些数据和模拟结果突出了在收缩过程中分解CdvB1：CdvB2共聚物的重要性，因此ESCRT-III丝状体不会拥挤颈部并防止断裂。
超高分辨率显微镜检验了CdvB和其他两个古生ESCRT-III同源物CdvB1和CdvB2的定位模式，揭示了导致分裂的事件序列。首先，组装一个CdvB环，然后该CdvB环将可收缩的ESCRT-III同源物CdvB1和CdvB2的组装模板化，以形成复合分隔环。进而由蛋白酶体介导的CdvB降解触发细胞分裂，从而使CdvB1：CdvB2共聚物收缩，从而拉动膜。在收缩过程中，CdvB1：CdvB2共聚物被分解，从而架空了膜位置以驱动脱落，从而产生了两个具有弥散性CdvB1和CdvB2的子细胞。
结论