科研 | 华东师大吴电明：解析土壤HONO排放机理 -硝酸盐还原菌驱动的高含水量土壤HONO排放 / 四六文摘

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导读

气态亚硝酸（HONO）是大气化学研究中的重要物质，直接影响大气氧化能力、灰霾的形成和空气质量等。土壤HONO排放是大气HONO的直接来源，也是国际上研究的热点。然而，目前对土壤HONO排放的机理偏少，且尚有争论。本文首次报道了高含水量土壤HONO排放的峰（湿峰，wet peak）。研究发现，在干湿交替过程中，土壤不仅在低含水量时排放HONO（干峰，dry peak），而且在含水量为75-140% WHC时也可以排放HONO（湿峰）。作者测定了全球不同生态系统土壤HONO排放，发现农田、草地、沙漠绿洲、滨海湿地芦苇等生态系统土壤都存在湿峰排放。通过室内灭菌、温度依赖性、氮添加等实验，证实了该过程是由微生物反硝化过程主导。进一步测定硝酸盐还原菌、反硝化细菌、敲除亚硝酸盐还原基因菌等纯菌的HONO气体排放，阐明了其微生物机理是亚硝酸盐累积引起的硝酸盐还原菌的氮素代谢过程。该研究深化了对土壤HONO排放的认识，并为生物地球化学氮素模型、大气化学模型等提供理论依据。

论文ID

原名：Soil HONO emissions at high moisture content are driven by microbial nitrate reduction to nitrite: tackling the HONO puzzle

译名：硝酸盐还原菌驱动的高含水量土壤HONO排放 — 解决HONO难题

期刊：The ISME Journal

IF：9.52

发表时间：2019年

通信作者：吴电明

通信作者单位：华东师范大学地理科学学院

实验设计

1 土壤样品

从全球各地采集表层土壤样品，0-5 cm或0-20 cm。本文用到的土壤包括，S1：德国小麦农田土壤；S2：印度玉米农田土壤；S3：印度水稻农田土壤；S4：埃及沙漠绿洲土壤；S5：中国湖北水稻农田土壤；S6：中国山东芦苇土壤；S7：爱尔兰小麦-玉米农田土壤；S8：爱尔兰草地转耕地土壤；S9：爱尔兰草地土壤；S10和S11：中国上庄小麦-玉米农田土壤。土壤样品S1-S4经40 °C烘干，其他样品室内风干。过2 mm筛后，4 °C冰箱内保存。

2 活性氮气体排放通量测定

土壤和微生物纯菌HONO、NO和N₂O排放通量由动态箱系统测定。前期研究表明，该系统测定的土壤气体通量能够模拟野外测定的排放通量。实验在黑暗条件下进行，测定温度25 °C。测定流程：50 g土壤样品放置于直径为88 mm的培养皿中，加入~ 50 g超纯水至淹水状态，然后移入体积为~ 47 L的特氟龙材料的动态箱内。该动态箱持续通入干燥的零空气，进气速率8 L min^-1，因此气体在箱内的停留时间小于6分钟。在土壤干湿交替的过程中，动态箱顶空HONO、NO、N₂O、O₃、CO₂和H₂O的浓度分别由LOPAP分析仪、热电42i-TL分析仪、量子级联激光器QCL、热电49i分析仪及LI-COR 840A等仪器测定。HONO和NO浓度的检测限分别是~5和80 ppt。土壤持水量（WHC）由加入土壤中水总质量、测定过程中蒸发到大气中的H₂O浓度及干土重等计算。气体排放通量由进气口和出气口气体浓度差、土壤面积、进气速率等计算。

3 乙醇灭菌土壤实验

称取50 g土壤样品S1，加入50 mL含量为70%的乙醇，灭菌~10小时。经干燥后，土壤加入50 g超纯水，利用动态箱系统测定灭菌后土壤HONO和NO气体排放。

4 温度依赖性实验

调整测定温度分别为5、15、20、25、30、35、40和45 °C，测定土壤样品S1的HONO和NO排放通量。

5 土壤淹水培养实验

将500 g土壤样品S1置于烧杯中，加入超纯水至~ 100%重量含水量，大约是160% WHC。用封口膜密封，并在封口膜表面扎7个小孔，以进行土壤与大气间的气体交换。然后将烧杯置于25 °C的气候箱中黑暗培养，并在培养30、54和200小时后，分别取出50 g土壤，加入7.45、0和7.45 mL1000 mg L^-1的硝酸钾溶液，相当于农田180 kg ha^-1的施肥量，测定HONO和NO的排放。

6 微生物纯菌实验

选取变形杆菌作为模式菌株，包括硝酸盐还原菌Escherichia coli K-12；反硝化细菌Pseudomonas G-179、Pseudomonas stutzeri JM-300 (DSM 10701)、Bradyrhizobium japonicum (DSM 1755)以及Rhodanobacter denitrificans (DSM 23569)，测定其厌氧HONO和NO排放。这些细菌都是兼性需氧菌，能够进行厌氧硝酸盐还原或者反硝化作用。

将这些细菌在厌氧培养箱中厌氧培养12-25个小时，然后取出50 mL细菌培养液，3000 rpm离心30分钟，去掉上清液，加入50 mL培养基，混匀。重复上述操作2次。将混匀后的50 mL细菌培养液置于培养皿中，内含50 g灭菌的玻璃珠。加入1 mL 100 mM的硝酸盐或亚硝酸盐溶液，以及0.5 mL 100 mM的葡萄糖溶液。这样，初始的硝酸盐/亚硝酸盐浓度是2 mM，葡萄糖浓度是1 mM。然后将培养皿置于动态箱中，用99.999%纯度的氮气代替零空气，厌氧测定HONO、NO和N₂O的排放通量。

7 敲除功能基因的纯菌实验

本实验中，用到的细菌载体为Eschrichia coli K-12菌株，其变异菌株分别为RK 4353（lacU169 araD139 rpsL gyrA non，含有nirBDC和nrfAB基因）和JCB 5225（RK 4353 ∆nirBDC::kan ∆nrfAB::cat，敲除nirBDC和nrfAB基因）。敲除基因的细菌菌株在厌氧条件下培养，并在培养实验结束后厌氧测定HONO和NO的排放通量。

8 功能基因表达测定及高通量测序

为了研究特定的功能基因响应，对土壤样品S1不同含水量的样品取样。每个含水量取6个重复土壤样品，并立即保存在-80 °C的冰箱中备用。土壤总DNA和RNA用RNA PowerSoil Total RNA Isolation Kit and DNA Elution Accessory Kit 试剂盒提取。纯化后的RNA样品用random hexamers和SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)反转录为cDNA样品，然后用PCR扩增相关的硝态氮还原基因（napA和narG）、亚硝态氮还原基因（nirS和nrfA）及16S rRNA基因。同时，用实时荧光定量PCR定量napA, narG, nirS和nrfA基因丰度。将扩增产物进行Miseq文库构建和Miseq 序列分析。Miseq 测序得到的结果采用RDP online analysis、Mothur 等软件进行分析。

结果

1 高含水量土壤的HONO和NO排放

德国小麦农田土壤（S1）和其他10个土壤都能够排放湿峰，对应的土壤含水量为75-140% WHC。与已知的干峰相比，湿峰HONO的最大排放通量为5-190 ng N m^-2 s^-1。该值是干峰最大排放量的10-90%，也能够解释外场观测到未知HONO排放源。这些结果表明了一个未被发现的土壤HONO排放源。

图1 德国农田土壤HONO和NO排放通量。

2土壤湿峰HONO排放与微生物硝酸盐还原有关

首先，将土壤S1用70%乙醇灭菌，灭菌后土壤HONO和NO排放分别下降了~40和10倍。其次，土壤HONO和NO排放随着温度的升高而增加，并在20 °C有一个峰值。再次，土壤淹水培养54小时后，HONO和NO排放通量几乎降为0；而添加硝酸钾后，土壤HONO和NO的排放又重新升高。同时，在高含水量土壤大量排放HONO和NO排放时，硝酸盐还原基因napA和narG、亚硝酸盐还原基因nirS和nrfA的丰度都显著的增加（图1）。这些结果表明，土壤湿峰HONO和NO排放与微生物硝酸盐还原有关。

3 厌氧硝酸盐还原菌（变形杆菌）驱动土壤湿峰HONO排放

通过测序发现，变形杆菌（Proteobacteria）主导了土壤湿峰HONO排放。16SrRNA以及功能基因narG、napA、nirK, nirS, 和nrfA转录多样性分别指示Telluria mixta (OTU 14)、Stenotrophomonas maltophilia (OTU 999)、Yersinia kristensenii (OTU 15)、Ochrobactrum anthropi (OTU 39)、Rhodanobacter D206a (OTU 314)和Y. kristensenii (OTU 2220)等细菌在HONO排放过程中起着重要的作用（图2）。

图2 德国农田土壤（S1）在HONO排放过程中16S rRNA, narG, napA, nirK, nirS 基因OTUs的变化

我们选取变形杆菌纯菌：硝酸盐还原菌(大肠杆菌，Escherichia coli K-12)，和反硝化细菌(Pseudomonas G-179; Pseudomonas stutzeri JM-300; Bradyrhizobium japonicum; Rhodanobacter denitrificans (DSM 23569) 做为模式细菌，测定其HONO和NO排放的差异。结果表明，当底物为硝酸盐和亚硝酸盐时，E. coli在厌氧条件下排放大量的HONO和NO气体（图3）。这可能是因为E. coli不含有亚硝酸盐还原基因（nirK和nirS），使得大量的亚硝酸盐在实验过程中累积，从而引起大量的HONO和NO排放。而反硝化细菌含有nirK或nirS基因，使得亚硝酸盐产生的速率和消耗的速率相差不大，亚硝酸盐浓度较低，排放的HONO较低。

图3 硝酸盐还原菌(Escherichia coli K-12)在底物为硝酸盐或亚硝酸盐、厌氧培养条件下HONO和NO气体排放通量

最后，作者比较了敲除功能基因nirBDC和nrfAB对HONO和NO产生的影响。结果表明，JCB 5225的HONO和NO排放通量比RK 4353高出近6倍，说明nirBDC和nrfAB基因影响亚硝酸盐的还原，进而促进了HONO和NO的排放（图4）。

图4 JCB 5225（敲除nirBDC和nrfAB基因）和RK 4353（含有nirBDC和nrfAB基因）在硝酸盐和亚硝酸盐培养下HONO和NO气体排放通量

4 土壤湿峰HONO排放的微生物机制

作者基于酸碱平衡理论和亨利定律的模型（图5a，过程1），计算了土壤和纯菌的HONO排放通量。结果表明，计算的灭菌对照实验的HONO排放量占实际测定值的30-45%，而计算的纯菌实验的HONO排放量只占实测值的< 5%。除了极端干旱的条件下（<1%WHC），计算的土壤HONO排放通量比实测值高；其它土壤含水量条件下，计算值都比实测值低。其主要原因可能是：（1）土壤HONO的排放通量决定于土壤颗粒表面pH，而不是土壤总体pH（bulk pH）（图5a，过程2）；（2）硝酸盐还原过程中产生的质子驱动力，造成细胞膜外表面的低pH环境，细胞膜外侧的酸化则促进HONO的产生（图5a，过程3，和图5b）。根据酸碱平衡，当细胞膜内外pH相差1.0-2.5时，计算的HONO排放量与实测值相当。这个结果也与典型的细胞膜两侧的pH差值相一致。土壤作为非均相体系，即使在高含水量的条件下，也会接触到大气环境。因此，HONO在细胞膜表面产生之后会立即被释放出来，通过气孔将HONO排放到大气中。

图5 土壤HONO排放的潜在过程（a），以及反硝化和硝酸盐还原过程中HONO产生的微生物机制模式图（b）。

5 土壤湿峰HONO排放的环境效应

土壤湿峰HONO排放是大气中HONO的一个新的来源，主要是硝酸盐还原菌作用下将硝酸盐还原为亚硝酸盐形成的，与之前土壤干峰HONO的排放主要与氨氧化细菌、氨氧化古菌的活性以及NH₂OH水解有关的机理不同。

降水、灌溉、施肥用有机肥等都会增加土壤的湿度，产生厌氧或微厌氧的环境。因此，我们的研究可以应用到多种类型的土壤，特别是农田土壤的活性氮气体排放。假设全世界的耕地面积为14.2×10¹²平方米（FAO数据），每年进行5次灌溉，20次降水事件（> 2mm h^-1），则估算的每年全球耕地土壤在高含水量下产生~ 112 Gg HONO-N和~ 94 Gg NO-N。如果只考虑能够进行灌溉的全球耕地3.3×10¹²平方米（FAO数据），每年进行5次灌溉，10次降水事件（> 2mm h^-1），则估算的每年全球耕地土壤在高含水量下产生~ 16 Gg HONO-N和~ 13 Gg NO-N。因此，全球耕地土壤在高含水量条件下产生的活性氮气体（HONO-N和NO-N）在29-210 Gg y⁻¹之间，大概占农田土壤NO_x排放的0.8–5.6%。

结论

土壤湿峰HONO排放是大气HONO的另一个来源，最大排放量是干峰最大排放量的10-90%，不同生态系统类型的土壤（特别是农田土壤）都广泛存在这一现象。土壤湿峰HONO排放的机理是亚硝酸盐累积引起的硝酸盐还原菌的氮素代谢过程。