科研 | ENVIRON INT：草地林地恢复的细菌指标能否为生态系统评估和微生物介导的人类健康提供信息？
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了解微生物群落如何随着环境退化和恢复的变化，或许能够提供理解联系人类、微生物群和自然界的未被充分研究的生态学的新视角。免疫调节微生物多样性和“老朋友”被认为是自然环境中生物多样性的补充，而在人类干扰和退化环境中比较缺乏。然而，很少有研究比较自然状态和人为干扰环境下的微生物群，并且对哪些微生物类群能够代表生态恢复（即帮助退化生态系统主要朝着一个更自然和生物多样化的状态）了解很少。我们使用创新性的自助重取样方法，对澳大利亚南部博尔德山一个10年的草地桉树林地恢复序列，在样点水平上对土壤细菌16S rRNA基因环境DNA数据进行重取样，鉴定出属水平的生态恢复指标。我们发现了两个关键的指标类群：随着恢复进程的推移，相对丰度下降的“机会主义者类群”和相对丰度上升的，更稳定、专一的“生态位适应类群”。我们在澳大利亚其他地方验证了这些结果，7个排名前10的机会主义者和8个排名前10的生态位适应者在人类干扰和自然状态取得的样品之间展现了一致的丰度差异。在此基础上，我们提出基于这些不同指标类群的比例来绘制生态系统状况的二维图。我们的结果也表明，在博尔德山，生态恢复到生物多样性更高的系统，能够提高潜在的免疫促进环境微生物类群的多样性。另外，环境机会主义者包括病原菌（芽孢杆菌、梭菌属、肠杆菌属、军团菌属和假单胞菌属）和扰动的生态系统有关。我们的方法是可推广的，有潜力为基于DNA的生态系统评估方法提供信息，并帮助制定可能促进微生物介导的人类健康获益的环境干预目标。
论文ID
原名：Can bacterial indicators of a grassy woodland restoration inform ecosystem assessment and microbiota-mediated human health?
译名：草地林地恢复的细菌指标能否为生态系统评估和微生物介导的人类健康提供信息？
期刊：Environment International
IF：7.297
发表时间：2019.6
通信作者：Craig Liddicoat
通信作者单位：阿德莱德大学生物科学与环境研究所
实验设计
土壤微生物群数据来自澳大利亚南部博尔德山的一个桉树占优势的恢复序列中，该序列包括植被清除样地，6年、7年、8年和10年四个植被恢复阶段样地，以及三个本土植被参比样地（A, B, C）。利用16S rRNA标记基因调查数据确定生态恢复的微生物指标，强调属水平的指标类群。我们创新性地使用合并样品自助重采样（merged-sample bootstrap resampling, 图1）通过3份微生物组样本量化样点特征，鉴定出生态恢复的关键类群。然后，将博尔德山的结果和澳大利亚可公开获取的土壤土壤环境生物区系数据集(Biomes of Australian Soil Environments dataset, BASE)对比，检验结果的普遍性。
图1 合并样品自助重采样流程图
结果
1 土壤微生物群随着恢复过程的改变和全澳大利亚模式的对比
博尔德山恢复序列土壤细菌群落组成的改变和澳大利亚其他地区更广泛的自然和人为干扰之间的细菌群落过渡一致（Fig. 2）。在澳大利亚其他地方，人为改变和自然样本的稀有OTU丰度数据（测序深度6377）表现出显著不同的组成重心（PERMANOVA: F=22.7, P=0.001），这一差异并不是两组之间的β分散导致的（F=3.7，P=0.062）。
图2 博尔德山恢复序列的表层土壤细菌群落（红色、绿色和蓝色的圆圈; n = 24)，从澳大利亚其他地方的自然(青色，n = 139)和人为改变(淡红色，n = 78)细菌群落。如图所示。微生物区系的显示是基于稀有的(序列深度= 6377)细菌16S OTU丰度的分类单元聚集在属或下一个可用的分类水平，使用Bray-Curtis距离的NMDS排序
我们鉴定出博尔德山和生态恢复有关的关键细菌属和未分类群（Fig. S6, Table S1）。为了提供使用合并样品自助重采样框架的趋势分类群的可视化信息，并且和传统稀有数据对比，我们画出了博尔德山排名前10的上升和下降的OTU相对丰度图（Fig. S8-S9）。我们并没有观察到一个模式来表明土壤条件对恢复处理和微生物组样本的过度偏差(Fig. S10)。在博尔德山，和恢复有关的排名前10的上升类群中的8个类群和排名前10下降类群的7个类群和澳大利亚其他地方自然和人为改变样本的OTU丰度差异表现一致(Table 1, Fig. S11-S12)。整个澳大利亚范围内人为改变和自然样本被分成两个可区分的集群，根据博尔德山恢复趋势的排名前10的上升和下降类群的累积OTU相对丰度做二维映射（Fig. 3）。博尔德山中，8个类群在植被清除样地并未出现，随着恢复阶段其OTU相对丰度提高，在参照样地也有出现(Table S2)；然而，有14个类群在植被清除样地中被发现，随着恢复降低，在参照样地中未见(Table S3)。
在整个澳大利亚人为改变和自然样本之间显示大量无丰度差异的类群(Figs. S13-S14)。然而，博尔德山随着恢复呈现上升趋势的类群的丰度差异和整个澳大利亚的数据保持一致(Fig. S13, S15)。这种相关性在博尔德山与植被年龄关系最密切的前几个类群中最强，并随着类群数量的增加而下降(Fig. S15)。
图 3 基于土壤细菌16S rRNA数据的生态系统状况二维图
2 与人类有关细菌的模式
与人类相关的属，随着博尔德山的恢复而增加，在自然样本中具有较高的差异丰度包括放线菌、伯克霍尔德菌和分枝杆菌。随着恢复而减少的属，在人为改变的样本中具有更高的差异丰度，包括嗜铬杆菌、芽孢杆菌、拟杆菌、金黄杆菌，梭菌，肠杆菌，黄杆菌，军团菌，假单胞菌、红球菌、鞘细菌和链球菌(Fig.4, Table S5, Figs. S16-S17)。
图 4 博尔德山人类相关分类单元OTU相对丰度与植被年龄的平均相关关系和澳大利亚其他地区人为改变和自然样品的平均OTU丰度差值的对比
3 α多样性、功能多样性和功能聚集
仅考虑稀有的OTU丰度数据，博尔德山恢复过程中的OTU α多样性没有明显的变化趋势。然而，当使用合并自助重取样的样点水平的密度分布时不同的信号出现了。我们观察到OTU α多样性随博尔德山的恢复显著上升趋势，这是由不同植被年龄组间平均自举结果之间95% 置信区间的差异决定的(Fig. 5)。然而，对于植被清除样地样本，估计的功能α多样性最高，并且随着恢复年龄保持稳定或下降，尽管只有20-30%的OTUs在推断功能时被代表。考虑到稀有OTU丰度数据和合并样本自举密度图，我们观察到澳大利亚范围内的人为改变与自然研究样本的OTU α多样性和功能α多样性都没有明显的趋势。在整个澳大利亚范围内的数据中，OTU α多样性和功能α多样性之间也没有明显的关系。在推断功能时，只有10-30%的OTU被代表。
图 5 通过合并样本引导重采样(B=100)，然后按植被年龄分组，得到博尔德山站点OTU alpha多样性的箱线图
在博尔德山恢复过程，前30个增加类群的功能产物与其他大部分博尔德山的样本聚集在一起，除了植被清除样地样本，其平均功能谱与其他被考虑的样本差异最大(Fig. 6)。在博尔德山恢复过程中的前30个减少的类群中，聚集了来自每年种植棉花、糖和小麦的农田的人为改变的样本;虽然这个集群也包含来自两个国家公园的样本。四个国家公园中的大多数都聚集在一起，包括园艺(苹果)和牧场在内的多年生土地利用的人为改变的样本中。
图 6 基于站点(行)和功能(列)z分数，从稀有的OTU丰度数据(序列深度= 16,704)推断微生物功能相对丰度
讨论
1 恢复过程中的细菌指标
我们的研究结果明显地表明，一个核心微生物群落是随着生态恢复而变化的。我们通过在整个澳大利亚的人为改变的和自然的样点显示出一致的差异丰度模式，证明了在前10名增加和前10名减少的大多数中相对丰度模式的支持，以及从博尔德山识别出与人类相关的分类群。我们可能期望恢复过程能够增加地上植物的稳定性、多年生性和多样性，并增加涉及不同植物物种和根系分泌物组合的根际相互作用。恢复后的土壤也会因扰动的减少而积累有机物，包括植物残体和真菌菌丝网络。随着微生物栖息地和饲料的复杂性和稳定性的提高，与高干扰程度或者定期清理的土地相比，土壤微生物群的改变不足为奇。在受干扰的环境中，微生物的栖息地和饲料可能经历巨大的波动，甚至可能崩溃，随着空缺的生态位出现，快速增长、适应性强的环境机会主义者有可能蓬勃发展。土壤微生物群的组成随着恢复发生广泛的变化，然而，在此我们揭示了在这些变化的群落中增加和减少的关键属。
我们发现，随着博尔德山的恢复，丰度增加排名10的类群中的8个在整个澳大利亚的自然样本中也显示出更高的差异丰度，包括与稳定的演替晚期生态系统相关的k选择生物和与特定资源需求相关的生物。DA101是土壤中发现的最丰富的细菌之一，尤其是在草原生态系统。钩吻念珠菌是一种母源性传播的内胚层线虫，其分布具有世界性，野外资料表明，这些线虫是k选择的生物，寿命长，繁殖率低。缓生根瘤菌是另一种普遍存在且数量丰富的细菌属，在森林土壤中占主导地位，但在DA101占优势的地方往往不重叠分布。单孢念珠菌和科瑞念珠菌的基因组研究表明，这两种微生物能够分解土壤中植物凋落物等复杂底物，生长缓慢，为K选择生活方式。红螺菌科中大多数属具有较好的光异养生长，可在有光、厌氧条件下生长，或者在黑暗中生长。红球形菌属是红螺菌属中嗜酸微生物。光异养生物不能将二氧化碳作为唯一的碳源，所以它们也使用来自环境的有机化合物。钩端螺旋菌科未分类类群的特征尚不清楚，这个科似乎被重新命名为硝基螺旋菌科，包括有铁氧化能力的钩端螺菌属和硝酸盐氧化能力的硝化螺菌属。
在博尔德山的恢复过程中，丰度下降排名前十的七个类群在整个澳大利亚范围内的人为改变样品的差异丰度更高，包括快速生长的机会主义的物种。芽孢杆菌在自然界中普遍存在，生长迅速，生活在好氧或厌氧条件下，能够形成耐药的内生孢子，在压力大的环境条件下长期生存。它们包括具有医学意义的炭疽杆菌(炭疽)和蜡样杆菌(与食物腐败和中毒有关)，以及许多通常无害的物种。在Ellin5290目和Ellin5301科中，未分类的分类单元均来自Gemmatimonadetes门，该门具有世界性的分布和多用途的、多面手的生态策略，能够适应包括低湿度条件在内的各种各样的环境。孢囊藻与芽孢杆菌具有相似的特性，是兼性厌氧或严格好氧的异养生物，能够形成能在环境中存活的内生孢子。嗜氨细菌是一种需氧的孢子形成细菌，专门利用草酸盐(一种新鲜植物组织的常见成分)作为碳和能量来源。黄杆菌属是好氧性、非运动性、非孢子形成的杆状菌，似乎是环境机会主义者，已从各种土壤、淡水和汽车空调系统的生物膜涂层部件中分离出来。目前还没有关于C0119类(绿弯菌门)未分类类群特征的资料。
我们建议，生态系统状况的微生物指标应能在一系列环境中检测到，并能够与有限范围的生物体提供有意义的关联。此外，我们期望对这些指标的分类等级的选择将代表对检测效果的敏感性和对特定生物体的特异性之间的权衡。我们的细菌16S数据适用于基因组水平的观测，反映了环境微生物群落调查数据的一种常见和经济有效的模式。利用相关系数作为效应大小的度量(所以我们的结果强调了与恢复之间的紧密关系)，使我们能够识别丰富和稀有类群的趋势。这种方法承认稀有类群可以发挥重要的生态作用。正如下面的进一步讨论，我们的土壤微生物组数据的二维图，在坐标轴上突出机会主义者的和生态位适应者的类群的比例，可能用于生态系统的监测和管理。
2 α多样性和功能的模式
我们通过合并样本引导重采样的方法观察到随着博尔德山的恢复α多样性有增加趋势。然而，在我们的研究中，与恢复有关的微生物组数据并不能用于任何其他样本。仅考虑自然和人为改变样品的一次性微生物组调查数据，我们发现两组之间的OTU α多样性或功能α多样性没有可推广的模式。换句话说，OTU和功能α多样性的变化在很大程度上是由位点特异性因素驱动的，而不是这些样本是属于自然还是人为变化。另一方面，功能特征确实出现了连贯的模式。增加的前30个类群与大多数博尔德山样本聚集在一起，可能反映了局域适应性。多年生农业和大多数自然样品聚集在一起，这可能反映了更稳定和成熟的土壤生态系统。一年生作物(即最受扰动的土壤)的样本也聚集在一起。功能数据还表明，并非所有的自然样本都表现相同，例如，两个国家公园的样本与年度作物样本聚集在一起。
我们提出了一个基于土壤细菌16S调查数据的二维生态系统状况指数，土壤eDNA样本可用于将研究区域划分为从退化的生态系统、到修复的中间阶段、到成熟的修复和参考生态系统。这种指数在跟踪恢复活动的进展、评估土地状况和确定恢复投资领域的优先次序方面可能有价值。图3的坐标轴反映了经常快速增长的环境通才和机会主义者(x轴)与适应成熟和参考生态系统的更稳定的小生境持有者(y轴)之间的比例变化。我们提供了一种与温带草地林地生态系统相关的优先削减方法，可以通过考虑来自更广泛的环境多样性的趋势分类群来改善该方法。例如，类似微生物所整理的数据集可以在更多不同的环境与目标建立一套通用指标。另外，在本地代表轨迹恢复或土地改良，对于一个给定的土壤类型和土地利用,可以为细菌提供本地化的参照系中特定的生态系统的变化(如低到中等到高可持续生产农业用地)，用以评估邻近土地的价值。
结论
使用我们新的合并样本引导重采样框架可以保存微生物组数据，并允许更详细地研究站点级别的信。我们在澳大利亚南部博尔德山的一个恢复序列中发现了与生态相关和与人类相关的关键趋势土壤细菌的OTU相对丰度和功能模式，这与来自澳大利亚各地的微生物样本人为改变和自然土壤的差异相一致。我们的研究结果有助于建立利用土壤eDNA微生物指标评估、管理和恢复生态系统状况的知识。我们还发现，环境机会主义者，包括潜在的人类病原体，在受干扰的生态系统中OTU相对丰度增加，这一发现可能对微生物介导的人类健康以及新的基于生态的健康改善和病原体控制干预措施具有重要意义。
评论
本研究创新性的使用合并样品重取样这一框架，使得在一次性或者较少取样的情况下，仍然能够对样点水平的土壤微生物组进行详细的研究。本研究将一个恢复序列的研究结果和来自澳大利亚其他地区的样本结果进行了对比，得到了较好的一致性。在此基础上，提出了一个二维的指数，可用于生态系统恢复和管理的评价；同时，也发现在干扰生态系统中，与人类健康相关的病原菌丰度较高。本研究也存在一些不足，如，仅能将土壤微生物组确定到属这一水平，不能更精细的划分其类群；缺乏微生物生物量数据和人类实际暴露程度；另外在使用分析工具进行微生物功能推断时也存在限制。
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