科研 | Nature：以肠道细菌为靶标的噬菌体可以减轻酒精性肝炎
编译：风清扬，编辑：小菌菌、江舜尧。
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酒精性肝炎是由于长期大量饮酒而导致的肝脏疾病，据统计，酒精性肝炎的患者在患病前6个月的死亡率高达20%~40%，严重的酒精性肝炎病人甚至在确诊后的90天内死亡。目前使用较多的糖皮质激素类药物仅能起到部分缓解作用，在疾病早期进行的肝脏移植被认为是治愈该疾病的唯一办法。然而，仅有少数患者能够进行肝移植手术。酒精引起的肝脏类疾病能够随着粪便菌群移植而转移，提示肠道微生物在酒精引起的小鼠肝脏类疾病中扮演着重要的作用，但其具体机制仍未得到阐明。
作者在此鉴定出了由粪肠球菌（Enterococcus faecalis）所分泌的外毒素溶细胞素（cytolysin）是导致酒精性肝病的罪魁祸首。与正常人群相比，长期大量饮酒的人群肠道中粪肠球菌丰度急剧增加。利用人源化肠道菌群小鼠，作者发现靶向粪肠球菌的噬菌体疗法能够有效杀灭分泌cytolysin的粪肠球菌并缓解肝脏损伤。该研究有望推向临床，通过定向杀灭致病细菌的方式精准编辑肠道菌群，用于治疗酒精性肝炎。
论文ID
原名：Bacteriophage targeting of gut bacterium attenuates alcoholic liver disease
译名：以肠道细菌为靶标的噬菌体可以减轻酒精性肝炎
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2019.11
第一作者：段屹
作者单位：美国加州大学圣地亚哥分校
实验设计
① 作者首先利用16s rDNA测序寻找慢性酒精摄取人群、酒精性肝炎患者以及正常人群肠道中细菌组成的差异，寻找到了显著差异菌群Enterococcus spp.。
② 随后使用qPCR检测粪便样本中Cytolysin-positive和Cytolysin-negative的粪肠球菌的比例，并利用生存曲线将其与患者生存率关联。
③ 接着使用酒精诱发肝炎小鼠模型，同时灌胃给予cytolytic E. faecalis和non-cytolytic E. faecalis，观察小鼠肝脏损伤情况。采用人源化肠道菌群小鼠模型评价酒精性肝炎患者肠道菌群对于酒精引起肝脏损伤的易感性，并且体外使用原代肝细胞给予Cytolysin，直接观察其对细胞的杀伤作用。
④ 基于上述研究结果，作者又采用靶向Cytolysin-positive粪肠球菌的噬菌体，观察其对于酒精性肝炎的缓解作用。
结果
1 溶细胞素与酒精性肝炎高死亡率密切相关
图1 粪肠球菌产生的溶细胞素与酒精性肝炎患者密切相关。Control：健康人群；AUD：滥用酒精人群；Alcoholichepatitis：酒精性肝炎人群。（A）PCoA分析显示各组人群肠道细菌组成的差异（β多样性分析）；（B）细菌丰度堆积图；（C）不同人群粪便样本中cytolysin-positive/negative的E.faecalis占比；（D）含溶细胞素与不含溶细胞素酒精性肝炎患者的生存曲线分析；（E）24位患者中分离得到共93种E.faecalis的SNP进化树分析。
2 溶细胞素加剧酒精引起的肝脏损伤
图2 cytolysin-positive E.faecalis定植加剧酒精引起的肝脏损伤。黑色：control组；棕色：分泌cytolysin的E. faecalis组；蓝色：不分泌cytolysin的E. faecalis组。（A）血清ALT水平；（B）肝脏甘油三酯水平；（C）肝脏切片油红O染色；（D-F）肝脏组织Il1b，Cxcl1和Cxcl2的mRNA表达水平；（G）肝脏组织中培养得到E. faecalis的CFU值。
随后我们分别将cytolysin-positive和cytolysin-negative的酒精性肝炎患者菌群定植于无菌小鼠中，构成人源化肠道菌群小鼠模型。同样地，我们发现cytolysin-positive患者的肠道菌群能够引起更为严重的肝脏损伤（图3A）、脂肪变性（图3B-C）、炎症水平（图3D-E）以及肝脏纤维化程度（图3F）。肝脏组织内的CylLs基因水平也显著升高（图3G），且这些现象与酒精的摄入与否无关。CylLL和CylLS能够对体外原代肝细胞有着直接的杀伤作用，表明两种cytolysin都会引起肝脏细胞的死亡（图3H）。
图3 Cytolysin-positve患者肠道菌群引起酒精性肝损伤的加剧。红色：小鼠移植cytolysin-positive No.1患者的肠道菌群；黄棕色：小鼠移植cytolysin-positive No.2患者的肠道菌群；绿色：小鼠移植cytolysin-negative No.1患者的肠道菌群；蓝色：小鼠移植cytolysin-negative No.2患者的肠道菌群。（A）血清ALT水平；（B）肝脏甘油三酯水平；（C）肝脏组织切片HE染色结果图；（D-E）肝脏组织Il1b，Cxcl1的mRNA表达水平；（F）肝脏组织Col1a1的mRNA表达水平；（G）肝脏cylLs基因的表达情况；（H）原代肝细胞体外给予不同浓度CylLS以及CylLL对于细胞的杀伤作用（检测上清LDH的释放）。
3 靶向cytolytic E. faecalis的噬菌体有望治疗酒精性肝炎
图4 噬菌体减轻酒精诱导Atp4aSl/Sl小鼠的肝脏损伤。（A）血清ALT水平；（B）肝脏甘油三酯水平；（C）肝脏组织切片油红O染色结果图；（D-F）肝脏组织Il1b，Cxcl1，Cxcl2的mRNA表达水平；（G）肝脏cylLs基因的表达情况；（H）粪便中粪肠球菌的数量；（I）血清乙醇含量；（J-K）在给予/不给与酒精情况下使用噬菌体对肠道菌群的影响（PCA主坐标分析）。
最后我们希望利用靶向cytolytic E. faecalis的噬菌体从而治疗酒精性肝炎。我们从污水中分离得到多种对于酒精性肝炎患者肠道内cytolytic E.faecalis有着明显降解作用的噬菌体，发现这些噬菌体属于长尾噬菌体或肌尾噬菌体（图A）。定殖了酒精性肝炎患者肠道菌群的无菌小鼠给予对应的噬菌体后，能够明显抑制酒精引起的肝脏损伤，包括ALT、甘油三酯以及脂肪变性水平降低（图5B-D），炎性因子（图5E-F）以及肝脏纤维化水平降低（图5G）。肠道内粪肠球菌的数量明显下降（图5H），并且噬菌体的引入也不影响肠道菌群的组成以及肠道对于酒精的摄取能力（图5I-K）。
图5 噬菌体减轻酒精诱导人源化肠道菌群小鼠的肝脏损伤。（A）电镜观察得到的噬菌体结构，Ef5.1、Ef5.2、Ef5.3、Ef5.4以及Ef2.2属于长尾噬菌体，Ef2.1以及Ef2.3属于肌尾噬菌体；（B）血清ALT水平；（C）肝脏甘油三酯水平；（D）肝脏组织切片HE染色结果图；（E-F）肝脏组织Il1b，Cxcl1的mRNA表达水平；（G）肝脏Col1a1基因的表达情况；（H）粪便中粪肠球菌的数量；（I）血清乙醇含量；（J-K）在给予/不给与酒精情况下使用噬菌体对肠道菌群的影响（PCA主坐标分析）。
为了证明噬菌体发挥的治疗作用是由于其对于cytolysin-positive的E. faecalis杀灭作用，而不是作用于cytolysin-negative的E. faecalis，我们又将cytolysin-negative酒精性患者的肠道菌群定植于无菌小鼠中，同样从污水中分离得到靶向non-cytolytic E.faecalis的噬菌体，发现这些噬菌体并不会缓解酒精性肝炎的疾病状态，尽管肠道内的粪肠球菌数量明显下降，表明cytolysin-positive的粪肠球菌是治疗酒精性肝炎的重要靶点。
图6 靶向non-cytolyticE.faecalis不能缓解酒精性肝炎。（A）电镜观察得到的噬菌体结构，Ef6.2、Ef6.3、Ef7.2、Ef7.3以及Ef7.4属于短尾噬菌体，Ef6.1、Ef6.4以及Ef7.1属于长尾噬菌体；（B）血清ALT水平；（C）肝脏甘油三酯水平；（D）肝脏组织切片HE染色结果图；（E-F）肝脏组织Il1b，Cxcl1的mRNA表达水平；（G）肝脏Col1a1基因的表达情况；（H）粪便中粪肠球菌的数量。
讨论
噬菌体疗法主要用于治疗肠道、泌尿系统等部位的细菌感染，这些研究表明了利用噬菌体疗法治疗细菌感染并不会如抗生素疗法一般引起肠道菌群的改变。
① 我们首先确证了能够分泌溶细胞素的粪肠球菌与酒精性肝炎患者的死亡率密切相关，并且其能够加剧酒精引发的小鼠肝脏损伤。
② 随后我们确证了溶细胞素是粪肠球菌引发肝脏损伤加剧的主要原因，并且溶细胞素能够直接导致肝细胞的死亡。
③ 接着我们使用噬菌体疗法，进一步确证了cytolytic E.faecalis是酒精引发肝脏损伤的原因，并发现靶向cytolysin-positive的粪肠球菌能够明显缓解肝脏损伤。
消除患者肠道中的粪肠球菌也许能够成为比现有治疗策略更加优秀的疗法，同时在环境中也能够轻松获取到靶向粪肠球菌的噬菌体。本文中我们利用噬菌体治疗了非感染性疾病，同时cytolysin也可以被认为是重度酒精性肝炎的biomarker。
评论
本文作者发现了影响酒精性肝炎进程的关键肠道菌群，即能够分泌cytolysin的粪肠球菌。这类细菌在正常人体肠道中几乎不存在，而在酒精性患者的肠道内占比高达~5.59%，表明了长期大量酒精服用对于机体肠道菌群结构的改变。与此同时，酒精能够破坏肠道黏膜屏障，导致在肝脏中也能检测到cytolysin以及粪肠球菌。这可能是酒精引起肝脏损伤的重要原因，体外实验表明了cytolysin能够直接导致细胞膜破裂死亡。而利用靶向cytolytic E.faecalis的噬菌体也使得精准调控肠道内某一特定致病细菌成为可能，同时噬菌体几乎不影响肠道菌群的组成和丰度结构，可能是比抗生素更为安全的一种治疗方式。本文为临床提供了治疗酒精性肝炎的全新治疗策略，在不久的将来可能在临床上能够得以推广。
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