科研 | Nature：18S和ITS测序揭示了真菌菌群通过激活MBL促进胰腺癌的发生
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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细菌生态失调往往伴随着结肠癌、肝癌等恶性肿瘤的发生，最近有研究表明其与胰腺导管腺癌（PDA）的发病机理也有关系。但是，真菌菌群与肿瘤的发病机理之间的关系尚不明确。本文中，研究者以小鼠模型为研究对象，并结合临床PDA患者的数据研究发现，真菌可以从肠腔内迁移到胰腺，且致病真菌通过激活MBL来驱动补体级联反应，从而促进PDA肿瘤的形成。
论文ID
原名：The fungal mycobiome promotes pancreatic oncogenesis via activation of MBL
译名：对真菌的测序揭示了肠道菌群的促癌机制
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2019.10.2
通讯作者：DeepakSaxena & George Miller
通讯作者单位：美国纽约大学医学院外科S. Arthur Localio实验室
实验设计
本文中研究者以小鼠模型为研究对象，首先为了验证真菌从肠腔迁移至胰腺，研究者通过绿色荧光蛋白标记真菌并饲喂小鼠进行检验；接着，研究者对患胰腺导管腺癌（PDA）小鼠模型和PDA患者的数据分析及α和β多样性检测分析，找出了PDA肿瘤内真菌与肠道或健康胰腺内菌群组成之间的差异，并以此为基础，通过基因敲除、沉默等分子生物学手段和实时荧光定量PCR和18S ITS测序等技术找出真菌菌群-MBL与PDA肿瘤形成之间的联系。
主要内容
图1. PDA的特征是具有独特的肿瘤内和肠道内菌群。a.采用荧光原位杂交技术（FISH）比较年龄、性别和体重指数相当的健康人和PDA患者的胰腺内真菌的丰度。每个小组中n=3。图中展示了典型图片，比例尺为20μm；b.采用FISH比较3个月大的同窝野生型小鼠（WT）和KC小鼠胰腺内真菌的丰度。每个小组中n=3。图中展示了典型图片，比例尺为20μm；c.采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测比较年龄、性别和体重指数相当的健康人和PDA患者胰腺内真菌DNA的含量。d.采用qPCR技术检测比较3个月大的同窝野生型小鼠（WT）和KC小鼠胰腺内真菌DNA的含量。e.GFP标记的S. cerevisiae通过填喂法饲喂野生型小鼠（n=15）和KC小鼠（n=9）。30分钟后收集胰腺，同时利用流式细胞术以不处理小鼠（n=6）为对照检测GFP+光点的数目。该实验重复两次。f~i.30周龄的KC小鼠肠道中（n=14）和肿瘤内菌群（11个生物学独立样本）通过18S ITS测序分析。f.基于Bray–Curtis差异矩阵的PCoA图。每个点代表来自肠道（红色）或胰腺（蓝色）的样本。通过PERMANOVA对样本进行集群鉴定。x轴和y轴分别代表差异性（%），椭圆表示95%的可信区间。g.对30周龄的KC小鼠的肠道中和肿瘤内菌群进行β多样性检测分析，结果包括观察到的OTUs和Shannon指数。h.以菌群的平均相对丰度为基础，就门的水平对菌群进行分类比较。NS，不显著。i.热图显示了肠道和胰腺中log2-转化的相对丰度占前20的真菌种属。j~l. 基于Bray–Curtis差异矩阵表征6周龄（j），18周龄（k）和30周龄（l）野生型小鼠和KC小鼠粪便样本中真菌群落的PCoA图。
研究者接着使用p48cre；LSL-KrasG12D（p48也称为Ptf1a）小鼠（以下称为KC小鼠）模型来评估在肿瘤发生过程中是否存在真菌生态失调的现象，这些小鼠在其胰腺祖细胞中表达了致癌的Kras，同时这也是一个PDA逐渐形成的模型。研究者对30周龄KC小鼠的肠道内和胰腺内真菌菌群进行比较，通过主坐标分析（PCoA）发现，肠道和胰腺肿瘤的微生物群出现聚群分离（图1f）。研究者还观察到，与肠道菌群相比，胰腺癌变后的α多样性降低了（图1g）。子囊菌和担子菌是胰腺组织中观察到的唯一菌门，然而在肠道中也检测到较低丰度的Mortierellomycota和Mucoromycota（图1h）。KC小鼠胰腺中最普遍的菌属是Malassezia，其丰度约为20%；与肠道中该属的丰度相比，该属在胰腺中的相对丰度明显增加（图1i）。值得注意的是，良性胰腺炎症中真菌浸润胰腺的迹象并没有增加。
为了确定致癌过程中肠道菌群是否进行了重新调整，研究者对KC小鼠和同窝对照小鼠的粪便样品进行了纵向分析。PCoA结果表明，虽然野生型小鼠和KC小鼠在生命早期具有相似的真菌群落，但到30周龄时，两种遗传背景下肠道菌群之间的β多样性出现差异（图1j~l）。因此，KC小鼠和野生型小鼠在30周龄时肠道内真菌群落的差异很大。
研究者接着分析了PDA患者粪便和肿瘤内的菌群。与小鼠模型的分析结果一致，病人肠道和肿瘤组织中最常见的类群为Ascomycota和Basidiomycota（图2a）。在属的分类水平上（再次与本研究中小鼠模型的数据一致），Malassezia在肿瘤组织中的普遍程度要高于肠道中的情况（图2b）。此外，α多样性分析显示，人体肠道菌群和PDA肿瘤组织菌群之间存在相当大的差异（图2c）。PCoA分析证实了PDA患者的肿瘤组织和肠道中存在差异明显的真菌群落簇（图2d）。此外，来自PDA患者胰腺中的菌群与健康个体胰腺中菌群出现分开聚集现象（图2e）。总的来说，这些数据表明PDA肿瘤的真菌菌群与肠道或健康胰腺中的真菌菌群不同。
图2. 患者的PDA与一种独特菌群相关。a~d.来自PDA患者的肠道（n=18）和肿瘤样本（13个生物学独立样本）进行18S ITS测序分析。a. 以菌群的平均相对丰度为基础，就门的水平对菌群进行分类比较。数据为平均值±SEM。b.分层树形图，根据图a中的分类组成，描述肠道和肿瘤之间的差异。c. 对PDA患者的肠道和肿瘤内菌群进行α多样性检测分析，结果包括观测到的OTUs、基于丰度的覆盖度评估（ACE）、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数。d. 基于Bray–Curtis差异矩阵表征PDA患者的肠道内（n=8）和肿瘤内真菌群落（n=13）的PCoA图。e. 基于Bray–Curtis差异矩阵表征PDA患者（n=13）和健康人胰腺内（n=5）真菌群落的PCoA图。
为了确定真菌生态失调在PDA形成过程中的影响，研究者将两性霉素B口服饲喂KC小鼠以减少其真菌菌群。真菌菌群的减少保护小鼠免于形成肿瘤（图3a）。同样，两性霉素B在PDA侵袭性原位模型中具有抑制肿瘤形成的作用，该模型中使用的肿瘤细胞衍生于Pdx1cre；KrasG12D；Tp53R172H（Tp53也称为Trp53）小鼠（以下简称KPC小鼠）（图3b）。真菌菌群的减少能够增强基于吉西他滨的化疗效果（图3c）。值得注意的是，使用氟康唑的治疗也可以抑制肿瘤的形成。但是，使用抗真菌剂并不能为无菌小鼠的肿瘤形成起到抑制作用。此外，与胰腺炎中真菌浸润没有增加的情况一致，抗真菌药物治疗并不能改善胰腺良性炎症。
图3. 真菌生态失调促进胰腺肿瘤的形成。a. 两性霉素B（ampho.）或媒介物处理的KC小鼠在3个月大的时候解剖。记录胰腺的重量（两性霉素B和媒介物处理的小鼠数量分别为n=5和n=11）。部分代表性菌株使用苏木精-伊红（H&E）或三色染料染色。根据H&E染色结果，确定腺泡面积保留的百分比同时检测正常导管的比例、滑膜导管化生（ADM）和胰腺上皮瘤内病变（PanIN）的分级。根据三色染色结果计算每个胰腺的纤维化面积分数。b.患PDA肿瘤的野生型小鼠分别使用媒介物或两性霉素B处理（每组小鼠数量n=16，数据包括3个独立生物学重复），在3周龄时解剖。收集肿瘤并称重。图中数据是至少5次实验的代表值。c.患PDA肿瘤的野生型小鼠分别使用媒介物（n=9只小鼠）、两性霉素B（n=6只小鼠）、吉西他滨（gem.）（n=8只小鼠）或两性霉素B和吉西他滨（n=6只小鼠）处理。在小鼠处理3周后解剖称量肿瘤的重量。d.两性霉素B处理后的野生型小鼠分别接种M. globosa（n=8只小鼠）、酿酒酵母（n=9只小鼠）、假丝酵母（n=8只小鼠）、曲霉（n=10只小鼠）或媒介物（n=8只小鼠），3周后解剖小鼠。收集肿瘤并称重。
为了确认真菌生态失调会加速PDA的形成，研究者使用两性霉素B和Malassezia globosa再次接种小鼠，使其在PDA和患癌小鼠模型中的丰度增加（图1i，2b）。值得一提的是，研究者在小鼠再接种实验中使用的M. globoseATCC菌株与PDA中丰度最高的Malassezia分类群具有100%的序列相似性。对照组小鼠使用念珠菌，酿酒酵母或曲霉等媒介物处理。其中，只有M. globose能够促进PDA的形成；其它分类单元或媒介物处理无效（图3d）。假丝酵母的再接种也不能加速PDA肿瘤的生长。
MBL是一种结合甘露糖的凝集素，可识别真菌病原体并激活补体级连反应的凝集素途径。根据基因组图谱（TCGA）中的转录组数据，MBL（也称为MBL2）的表达与PDA患者的存活率降低有关。研究者推测真菌可能通过激活MBL促进肿瘤的发生。因此，MBL无效的小鼠表现出延迟肿瘤形成的现象（图4a）。Mbl基因的敲除也可以保护小鼠抑制KPC小鼠细胞原位肿瘤的生长，从而使小鼠的存活时间延长（图4b,c）。此外，使用两性霉素B处理并不能抑制肿瘤生长从而为MBL无效的小鼠提供保护。同样，Malassezia（与C型凝结素受体结合）也不会加速MBL无效小鼠中肿瘤的形成。
图4.真菌通过激活MBL-C3促进PDA的形成。a. KC（KC；Mbl+/+，n=11，作为对照）和KC、MBL无效（KC；Mbl-/-，n=7）小鼠在3周龄时解剖。肿瘤称重并用H&E或三色染料染色，同时像图3a那样分析胰腺的发育异常和纤维化。对照组KC小鼠的数据与图3中所示的媒介物处理数据一样。比例尺为200μm。b. c.野生型和MBL无效小鼠接种来自KPC小鼠的原位肿瘤细胞，并在小鼠3周龄大小的时候分析肿瘤的生长情况（每组小鼠数量n=22）（b）和成活率（野生型小鼠n=8，MBL无效小鼠n=5）（c）。图中数据是至少5次重复实验的代表数据。d.Mbl-/-小鼠接种来自KPC小鼠的原位肿瘤细胞，在接种14后通过剖腹术接受肿瘤内注射重组C3a（rC3a）（n=6）或媒介物（n=6）处理，然后测量体积。在21天后收集肿瘤并称重，并计算自注射后体积的变化量。该实验重复2次。e.野生型（n=10）和C3-/-（n=9）小鼠接种来自KPC小鼠的原位肿瘤细胞，在小鼠3周龄时分析肿瘤生长情况。图中数据是3次独立实验的代表数据。f.g. 野生型小鼠皮下植入来自KPC小鼠的肿瘤细胞后，针对C3aR（也被称为C3ar1）使用短发夹RNA（shRNA）处理。f.采用qPCR技术检测C3aR敲除的效果。g.21天后定量分析肿瘤的重量（shRNA处理小鼠n=9，shC3aR 1 and 2处理小鼠n=5）。h. 野生型和C3-/-小鼠分别被媒介物处理（野生型n=3，C3-/-小鼠n=4）或两性霉素B处理（每种遗传背景下小鼠数量n=4）后接种来自KPC小鼠的原位肿瘤细胞，并在3周后解剖。收集肿瘤并称重。图中数据是两次实验结果的代表性数据。i.概要图描绘了胰腺肿瘤形成过程中真菌菌群-MBL发挥作用的过程。
此前C3补体级连反应已经在PDA和其他癌症中进行了研究，其通过多种机制可以有效诱导癌症的发生，这些机制包括增加肿瘤细胞的增殖运动性和侵袭性，以及破坏适应性免疫反应等。因为MBL启动了可以触发C3转化酶的补体级联反应的凝集素途径，因此研究者假设真菌-MBL通过补体级联反应激活并促进PDA的进程。与MBL的情况相似，C3的表达与PDA患者生存率降低的趋势有关。研究者还发现C3a在KC小鼠的胰腺中表达稳定，而这种现象在野生型或MBL无效的KC小鼠中几乎不存在。与研究者的假设一致，重组的C3a加速了体外KPC细胞的增殖和体内KPC肿瘤的生长（图4d），而C3缺陷型小鼠的PDA进程受到抑制（图4e）。同样的，PDA细胞中C3aR基因的沉默（图4f）也减弱了肿瘤的生长（图4g）。此外，研究者发现目标菌群在C3缺陷型小鼠中没有其它作用（图4h）。总体而言，这些数据表明胰腺真菌组需要MBL-C3系列物质来促进肿瘤的生长。
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