科研 | SBB：土壤生物结皮演替增强了微生物相互作用（国人作品）
编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。
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尽管测定生物土壤结皮（BSCs）的微生物群落结构和多样性的变化的研究在增加，然而BSCs微生物相互作用还没有完全弄清楚。
本研究在中国西北毛乌素沙地土壤，应用了一个基于网络的方法对四个阶段的BSCs（裸砂、物理结皮、藻类结皮和苔藓结皮）建立了细菌，真菌以及细菌-真菌相互作用网络。
结果表明在四个发展阶段细菌网络关键的门分别是Firmicutes, Proteobacteria, Cyanobacteria 和 Actinobacteria. Ascomycota是真菌网络在所有阶段关键的门，并且藻类和苔藓结皮的网络中又一个关键门是Basidiomycota。随着BSCs的发展，细菌和真菌网络复杂性增加，变得更加的聚类和连接，表明随着BSC发展微生物相互作用增强的格局。在所有的网络中正向的关系占主导作用，表明在BSCs发展中微生物的协同作用是主要的。有趣的是，随着BSCs的发展，细菌网络负向的关系比例增加，在真菌网络中减少，表明在细菌群落中有更多的群落内部竞争，在真菌群落中呈现较少的群落内部竞争。环境因子，尤其是总的碳和总的有机碳分别限制大多数细菌和真菌群落。我们的发现对于理解在干旱和半干旱沙地景观组成的荒漠生态系统中BSC发展机理和生态系统功能提过了一个新的视角。
论文ID
原名：Network analysis reveals the strengthening of microbial interaction in biological soil crust development in the Mu Us Sany Land, northwestern China
译名：在中国西北毛乌素沙地土壤结皮发展过程中的网络分析揭示了微生物相互作用的增强
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.795
发表时间：2020.05
通讯作者：吴波
通讯作者单位：中国林业科学院
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Web results那不勒斯腓特烈二世大学
实验设计
研究地点（38°28´N，108°42´E）位于内蒙古自治区毛乌素沙地，由乌审旗（县）政府管辖。毛乌素沙地海拔1200-1600米；这地区总的面积约为40000平方公里。该地区属典型的半干旱大陆性气候，气候温和，降水量少。年平均温度是8.4℃，最高（7月）和最低（1月）月平均温度分别为22℃和-11℃。在该实验地点长期年平均降雨量为341mm yr-1，大约70%的降雨量发生在7月到9月。毛乌素沙地由固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘组成。根据中国土壤分类，沙丘土壤覆盖大于90%的沙子，被定义为砂土（Chen et al., 1998）。在该研究地点自然植被是沙地草地，黑沙蒿占优势。不同类型的BSCs在固定和半固定沙丘广泛分布，它们有着截然不同的形态特征（图S1）。裸砂被未压实的沙粒覆盖（图S1a），物理结皮是灰色的，厚度在1到5毫米（图S1b）。藻类结皮表面光滑平整且颜色深，厚度大约为5到10毫米（图S1c）。苔藓结皮有一个粗糙的表面，厚度10-20毫米，在干旱的时候颜色深，在湿润的时候颜色绿（图S1d）。
BSC样品在2017年8月18日采集。在一个相对平的固定沙丘选择一定的面积（大约100m ╳100m），并且平均分成8个子样方（12.5m ╳100m）。在每个子样方中，用培养皿（9厘米直径）确定亚采样区，然后用无菌铲子将地皮样品与土壤分离。对每个BSC发展的阶段，5个子样品随机的收集并且混合成一份样品，从而降低空间异质性。在每个子样方内从每个灌木区的空隙随机收集物理，藻类和苔藓结皮的样品。裸砂样品从靠近固定沙丘的流动沙丘采集。从这些沙丘中总共收集了32个样品（4个阶段╳8个重复）。将每个样品装入聚乙烯袋中，放在保温箱里的冰上，并立即运输至实验室进行后续分析。BSC样品过2毫米筛，以去除可见的根和石头，然后分成3部分。第一部分储藏在4℃，用于分析土壤含水量（SWC），硝态氮（NO3-N），铵态氮（NH4-N），微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）。第二部分风干后用于测定总碳（TC），总氮（TN），总磷（TP），总有机碳（TOC）和土壤pH。第三部分储藏在-80℃，用于土壤DNA的提取。
使用引物515F和806R扩增细菌16S rRNA基因的V4区。使用引物ITS5-1737F和ITS2-2043R扩增真菌rRNA基因的ITS1区。16S和ITS1基因的扩增和高通量测序使用Illumina Hiseq 平台（PE2500）。
本研究采用随机矩阵理论构建微生物相互作用网络。包括四个步骤：数据采集、数据转换、成对相似矩阵计算及邻接矩阵确定。对OTUs的丰度进行对数转换。如果成对的有效值可用，则用一个小值（0.01）填充丢失的数据。随后，利用Spearman相关系数计算两种微生物之间的相互作用，构建了一个对称相关矩阵。然后，通过取绝对值将该相关矩阵转化为一个相似矩阵。应用一系列从0.3到1的阈值，间隔为0.01，直到在网络中检测到非随机模式时识别出适当的阈值。当固有值分布的间距服从泊松分布时，确定非随机模式。仅使用高于最佳阈值的相关性来定义邻接矩阵。为了在相同的条件下比较网络，在我们的研究中对于每个BSC发展的阶段使用阈值0.84来建立网络。
根据Deng 等（2012）的方法计算了全局的网络属性，包括平均路径长度，平均聚类系数，连接性和模块化。平均路径长度和平均聚类系数反应了网络节点的分散程度。联通性，也称为节点度，代表着任一两个节点的连接强度，模块化作为一个网络怎样分成几个模块的一种测量。在网络中的模块作为一组OTUs被描述，在它们当中高度连接，但是在与OTUs外的组几乎没有连接（Olesen et al., 2007）。网络中节点的拓扑角色基于每个节点的模块内连接度（Zi）和模块间连接度（Pi）分成4种类型：外围节点（Zi≤2.5，Pi≤0.62），连接节点（Zi>2.5，Pi≤0.62），模块中心点（Zi≤2.5，Pi>0.62）和网络中心点（Zi>2.5，Pi>0.62）。外围节点仅仅只有一些连接，它们几乎指向自己模块中的节点。在它们自己的模块中，模块中心点与许多节点高度连接，然而连接节点与不同的模块高度连接。网络中心点扮演着模块中心点和连接节点。Olesen 等（2007）强调，网络中心点，模块中心点和连接节点被认为是网络结构中的关键节点。
使用Mantel test测定不同BSC发展的阶段环境的变量和网络连接的相互作用。初步计算OTU重要性，定义为OTU相对丰度与环境变量Pearson相关系数的平方。然后计算了OTU重要性和网络连接的相关性。为了进一步评估环境变量在整个BSCs发展阶段对微生物相互作用的影响，我们以相同方式建立了环境变量和OTUs之间的网络。这个研究所有的网络使用Molecular Ecological Network Analyses pipeline（MENA, http://ieg4.rccc.ou.edu/mena; Deng et al., 2012）构建和分析。
所有的统计分析使用R软件中的vegan包。在四个BSC发展的阶段使用单因素方差分析比较土壤物理化学属性特征和微生物生物量的变异。使用LSD进行多重比较。差异在P<0.05水平上统计显著。使用Cytoscape 3.6.1和Gephi0.8.2对网络进行可视化。
结果
1 生物化学特征和微生物生物量
从裸砂到苔藓结皮SWC的结果显著增加（表1）。类似地，随着BSC发展，样品中的TOC，TC和TN也循序渐进的增加。随着从裸砂到苔藓结皮的改变，TOC和TC分别显著增加22.8和9.6倍；TN仅仅增加了3.4倍。相反地，从裸砂到苔藓结皮，土壤硝态氮含量和土壤pH降低。在四个发展阶段中土壤铵态氮含量没有呈现显著差异。从裸砂到苔藓结皮，MBC增加了5.98倍，MBN增加了5.58倍（图S2）。
2 一般的网络属性
对于BSCs四个发展阶段网络分别建立并测定了它们的拓扑属性。对于细菌，所有的网络连接曲线都与幂律模型有很好的拟合（R2值范围从0.82到0.93；表2）。这些结果表明这些网络是无标度的，表明网络中的大多数节点与其他节点没有或只有很少的连接，即使少数节点有大量的连接。而且，平均路径长度值的范围在3.64到4.40之间，接近于网络节点数的对数。这一结果表明，这些网络具有小世界的性质，表明网络中的大多数节点可以通过少量的路径连接。此外，模块化值的范围在0.73到0.78之间，这表明每个网络可以分成多个模块（值>0.4通常被定义为模块结构的阈值）。在四个网络中聚类系数的均值，路径长度平均值以及模块化都高于其他随机的网络，表明目前的网络相互作用显著不同于其他随机产生的网络。
类似于细菌网络，四个发育阶段的真菌网络（表2）也记录了较高的幂律系数（从0.82到0.95）。平均路径长度值在3.77到4.37之间，与网络节点数目的对数结果很接近。此外，网络中的模块值在0.62到0.80之间。四个发展阶段网络的平均聚类系数、平均路径长度和模块度均高于随机网络。我们的结果表明，真菌网络具有表征复杂系统的拓扑特性，包括无标度性、小世界性和模块性。Pocock 等（2012）强调了这些典型的拓扑属性是复杂系统的网络的特征。
3 在BSCs不同发展阶段的网络属性
对于细菌，从裸砂到苔藓结皮，网络中的节点数目从64增加到了97（表2）。网络中的节点代表不同物种中的联系。在裸砂的网络中记录到的连接最少（86）。随着BSCs的发展，结皮的网络中的数目增加到104（物理结皮），218（藻类结皮）和220（苔藓结皮）。在裸砂，物理结皮，藻类结皮和苔藓结皮的网络中分别记录了76，75，154和115正向连接；记录的负向连接值分别是10，29，64和105。尽管在四个网络中正向连接多于负向连接，正向连接的比例有增加的趋势（从裸砂中的88.4%到苔藓结皮的网络中的52.3%）并且负向连接的比例也有增加的趋势（从裸砂中的11.6%到苔藓结皮的网络中的47.7%）。此外，从裸砂到苔藓结皮的网络中平均路径长度值减少了17.3%。而且，从裸砂到苔藓结皮的网络中连通性（7.9%）和模块性（6.7%）值增加了。
对于真菌，节点数目从裸砂中的62增加到了苔藓结皮的网络中的87（表2）。连接数从裸砂中的105增加到了125（物理结皮），157（藻类结皮）和206（苔藓结皮）。具体而言，在裸砂，物理结皮，藻类结皮和苔藓结皮的网络中正向连接分别是78，106，143和190；结皮网络中负向连接的值分别是27，19，14和16。类似细菌网络，在所有真菌网络中正向联系也占主导。然而，不像细菌，在真菌网络中正向连接所占的比例证明有增加趋势（从裸砂中的74.3%到苔藓结皮的网络中的92.2%）；负向连接的比例是一个相反的趋势（从裸砂中的25.7%到苔藓结皮的网络中的7.8%）。此外，真菌网络的平均路径长度值从裸砂到苔藓结皮中减少了13.6%，类似于细菌网络。
4 在不同的BSC发展阶段的关键微生物类群
在所有的网络中一共检测到11个细菌门，在4个BSC发展阶段细菌网络显著不同（图1）。具体而言，在裸砂网络中检测到6个门，包括Proteobacteria，Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes,Acidobacteria 和Planctomycetes（图1a）。在物理结皮中增加了两个门（Cyanobacteria和 Gemmatinoadetes），在藻类结皮中增加了三个门（Cyanobacteria, Gemmatinoadetes 和Verrucomicrobia），在苔藓结皮的网络中增加了五个门（Cyanobacteria, Gemmatinoadetes, Verrucomicroiba, Cloroflexi 和Nitrospirae）。通过关注连接性最高的门，通常被认为是网络中的关键分类群（Layeghifard et al.，2017），我们发现在网络中占据关键位置的门在四个发展阶段中不同。在裸砂，物理，藻类和苔藓结皮的网络中关键门分别是Firmicutes, Proteobacteria, Cyanobacteria 和Actinobacteria。
对于真菌，在四个发展阶段的网络中，仅仅有4个门，Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota和Zygomycota（图2）。在四个发展阶段Ascomycota被认为是关键的门，然而另一个门Basidiomycota在藻类和苔藓结皮中也是重要的门。
5 在不同发展阶段模块中心点和连接节点
网络中确定的模块由一组分类单元组成，这些分类单元可能共享一个共同的系统发育，和/或类似的生态位，或具有潜在的相互作用。基于模块内连接（Zi）和模块间连接（Pi），每个节点可以划分为四个拓扑角色：外围节点、连接节点、模块中心点和网络中心点。在任何细菌发育阶段的网络中均未检测到网络中心点（图S3a）。大部分节点（94.6%）属于外围节点，随着BSC发展模块中心点和连接节点数量增加。具体而言，在裸砂网络中观测到2个模块中心点，在物理结皮中增加到3个，在藻类和苔藓结皮的网络中都增加到6个。连接节点呈现出与模块中心点类似的趋势，从裸砂中的2个增加到物理结皮中的3个，藻类结皮和苔藓结皮的网络中的5个和7个。不同发育阶段网络中的模块中心点和连接节点分布在不同的分类群中（表S1）。例如，藻类结皮的网络中的模块中心点与来自Cyanobacteria的Microcoleus、来自Proteobacteria的未知属以及来自Actinobacteria的Blastococcus和Modestobacter相关联；苔藓结皮的网络中的模块中心点与来自于Actinobacteria的Geodermatophilus, Pseudonocardia和Blastococcus，来自于Proteobacteria的Microvirga以及来自于Verrucomicrobia的Chthoniobacter有联系。
类似地，所有四个真菌网络中的大多数节点都属于外围节点（86.4%），没有检测到网络中心点（图S3b）。模块中心点的总数从裸砂的网络中的1个增加到物理结皮中的4个，藻类结皮中的7个，苔藓结皮的网络中的8个。尽管在裸砂的网络中未检测到连接节点，但在物理结皮中检测到两个连接节点，在藻类结皮中检测到四个连接节点，在苔藓结皮的网络中检测到五个连接节点。四个发展阶段网络中的模块中心点和连接节点隶属于不同的分类群，更多细节见表S2。
6 细菌和真菌的相互作用
随着BSC的发展，利用四个网络的相互作用研究了细菌和真菌的共存格局（图S4）。网络总的连接数是：在裸砂中118，物理结皮中115，藻类结皮中120和苔藓结皮中133。在这些连接中，在裸砂中鉴定了80个正向连接，物理结皮中66个，藻类结皮中59个以及苔藓结皮的网络中64个。在裸砂中记录了38个负向连接，物理结皮中49个，藻类结皮中61个以及苔藓结皮的网络中69个。根据细菌个体网络，正向连接的比例从裸砂中的67.8%减少到苔藓结皮的网络中的48.1%，负向连接从裸砂中的32.8%增加到苔藓结皮的网络中的51.9%。
7 环境的变量与网络结构之间的联系
在不同的BSC发展阶段使用Mantel test用于探索环境变量与网络结构之间的联系。对于细菌网络，裸砂的网络的连接性与任何环境变量之间均未检测到显著相关性（表S3）。然而，物理结皮的网络中的连接性与TOC，TC，TP和土壤pH有紧密联系。此外，在藻类和苔藓结皮的网络中连接性与TOC，TC，TN，TP，SWC，NO3-N都有联系。真菌网络的结果与这些细菌网络的结果类似，裸砂的网络的连接性与环境变量之间未检测到显著相关性（表S4）。物理结皮的网络的连接性与TOC和土壤pH显著关联。藻类结皮中的连接性与TOC，TN，NO3-N以及SWC显著关联。苔藓结皮的网络中的连接性与TOC，TN，土壤pH，NO3-N以及NH4-N显著关联。
随着BSC发展，在细菌和真菌网络中鉴定了TC，TOC，SWC，TN，TP，NO3-N，NH4-N和土壤pH（图3）。TC记录了细菌网络中最高的节点连接性（图3a），TOC记录了真菌网络中最高的节点连接性（图3b）。
讨论
1 随着BSC的发展关键类群的变化
随着BSC的发展，细菌网络关键门（高连接性的门）显著改变（图1）。在裸砂的网络中，Firmicutes门被确定为关键的类群（图1a）。作为拓荒者，Firmicutes可以形成内生孢子并抵抗干燥，从而通过稳定基质和输入养分来降低环境压力，从而能够在营养不良的裸砂中生长。在物理结皮的网络中，Proteobacteria门是关键的类群（图1b）。对BSC形成至关重要，Proteobacteria可以分泌胞外多糖结合沙粒，防止土壤风蚀。此外，Pepe-Ranney 等（2016）的研究记录了Proteobacteria在BSC形成的关键早期阶段是N2固定最重要的贡献者。在藻类结皮的网络中，Cyanobacteria成为关键的门（图1c）。Kidron 等（2008）的发现表明，一旦土壤表面固定，Cyanobacteria由于它们的快速生长，迁移以及对极端环境强的适应性可以快速定殖。我们发现Cyanobacteria的成员Microcoleus属在藻类结皮的网络中持有关键位置，以及之前的研究表明，它可以使用纤维束将土壤颗粒结合在一起（Weber et al.，2016）。此外，Cyanobacteria的一些heterocystous成员在藻类结皮中是固定大气中N2主要的贡献者。因此，我们的结果表明，在藻类结皮阶段Cyanobacteria战胜了Proteobacteria，并在结皮的维持以及大气氮气的固定扮演着关键的角色。此外，在BSCs里，作为最主要的生产者，Cyanobacteria也能固定大气中的碳，并转移到土壤中。在苔藓结皮的网路中Actinobacteria是关键类群（图1d）。在BSCs中我们观察到在养分水平发展良好（表1），这可能与生物量降解微生物的数量有关。Zhang 等（2018b）在发展良好的BSCs中，也记录了Actinobacteria的丰度。根据Vtrovsky 等（2014）的发现，Actinobacteria的成员能分解复杂的化合物，例如多糖和酚类化合物，并且增加BSCs的养分状态。此外，Actinobacteria的属，例如Actinoplanes, Pseudonocardia和Streptomyces是菌丝体。在苔藓结皮的网络中，Actinoolanes和Pseudonocardia的一些成员在维持苔藓结皮结构中扮演着重要的角色。
对于真菌，在所有4个BSC发展阶段的网络中Ascomycota是关键门（图2）。大部分成员富含黑色素细胞壁，在沙漠环境中能够抵抗多种非生物压力，例如干燥和高紫外线辐射。因此，在BSC发展中，在抵抗严厉的环境中Ascomycotaota扮演着一个重要的角色。这些结果与Abed 等（2013）和Liu 等（2017b）的结果一致。而且，在藻类和苔藓结皮的网络中Basidiomycota是另一个关键门（图2c和d）。这可能与（Artemisia ordosica是主要的当地植被，并且Basidiomycota能分解它的凋落物）的事实相关联（Zhu et al., 2016）。腐生真菌成为真菌群落优势类群，这也可能是真菌群落和TOC之间有紧密联系的主要原因（图3b）。
2 BSC 发展和微生物相互作用的改变
随着BSC的发展，网络拓扑结构的改变证明了细菌和真菌的相互作用都变得更复杂和加强。这通过一下三点呈现（i）在细菌和真菌网络中连接数目的增加（表2）；（ii）网络变得更聚类和连接（表2）；（iii）模块中心点和连接节点的数目有本质的增加（图S3）。我们的结果表明细菌和真菌相互作用与土壤含水量和土壤养分条件紧密关联（例如，TC，TOC，TN和pH；图3）。因此，在BSC发展早期阶段简单的网络结构可能归因于在不利的水分含量条件下破碎和不连接的土壤相（表1），减少或者避免了微生物之间的直接联系（Wang and Or, 2013）。此外，在BSC发展后期阶段一个更复杂的网络结构可能归因于两个原因：（i）土壤含水量的增加导致土壤相通过液压连接变得更紧密，为微生物相互作用提供了途径；（ii）养分条件的提高支持微生物生物量的增加（图S3），为物种之间的相互作用提供了更多的机会。根据之前的研究，与相对简单的网络相比，复杂网络具有更高的资源和信息传输效率，支持更多的功能。此外，高度复杂的网络会导致更稳定的微生物群落，因此会提高它们对环境的耐受性。因此我们的结果表明随着BSC的发展，微生物群落稳定性连续增加，对促进半干旱地区土壤物质循环，提高土壤抗风蚀能力具有重要意义。
正向和负向连接，代表正向或者负向相互作用，在网络中是非常重要的特征。正向相互作用可能反应物种之间合作和生态位重叠，负向相互作用可能反应物种之间的竞争和生态位分离。在我们的研究中，在所有四个发展阶段，在细菌和真菌网络中观测到的正向连接都多于负向连接（表2）。指出了微生物协同作用在沙漠生态系统的重要性，在那里大多数微生物物种与其他物种合作来抵抗恶劣的环境条件（Hoek et al., 2016）。然而，我们也注意到了在细菌网络中负向连接的比例在逐渐增加（表2），表明随着BSC的发展细菌物种之间的竞争逐渐增加。真菌网络的结果是相反的（表2）。这两个相反的趋势可能归因于两个原因。首先，细菌一般比真菌生长的更快。此外，随着BSC的发展，营养物质的增加会刺激细菌的生长，从而加剧对营养物质的竞争。第二，真菌和细菌群落对水分有效性的响应不用。Wang 等（2018）观测到了随着土壤含水量的增加，细菌成员之间的竞争增强，这与我们的结果一致。相反地，真菌由于他们通过宽菌丝获取土壤水分的能力很强，使得他们对土壤含水量的改变不敏感。
细菌和真菌的相互作用也是重要的。我们的研究结果表明随着BSC的发展细菌和真菌之间的竞争增加，这与之前的研究一致。随着BSC的发展和养分状态的提高，细菌和真菌群落将会扩张并且进一步增加它们对养分的竞争。因为竞争可以稳定群落中的共振，并且促进网络的稳定性（Coyte et al., 2015），在半干旱区域BSC的发展可能会扮演着增加沙漠生态系统稳定性的角色。
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