综述 | IJMS: MicroRNA在血友病和血栓形成中的作用
编译：思越，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Role of microRNAs in Hemophilia and Thrombosis in Humans
译名：microRNA在人类血友病和血栓形成中的作用
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.183
发表时间：2020年5月20日
通讯作者：Chintamani D Atreya
作者单位：美国食品药品监督管理局
DOI：10.3390/ijms21103598
主要内容
1.出血性疾病与血栓
出血性疾病是一组无法形成血凝块的疾病。它们的特点是受伤，手术，外伤或月经后出血延长。人体会产生13种凝血因子，任何一种凝血因子的缺乏都会导致轻度，中度或重度出血性疾病。相反，由于某些凝血因子（凝血因子VII，VIII，IX，XI和von Willebrand因子）的水平较高，血凝块可能导致血栓的形成。
凝血因子缺乏和过度产生均可导致疾病。因此，凝血因子动态平衡的维持对于避免疾病的发生至关重要。基因调控在多种水平上起作用，可发生在基因转录水平（mRNA，聚腺苷酸化和拷贝数），转录后水平（翻译干扰）和翻译后水平（磷酸化，糖基化等）等。microRNA（miRNA）介导mRNA表达，已成为调节基因表达的关键生物学机制。miRNA与mRNA 3'非翻译区（UTR）结合，并通过复杂的过程终止或调控基因表达，本文总结了与出血性疾病、血栓及凝血级联反应与miRNA的关系（图1）。
图1 miRNA在出血性疾病、血栓及凝血级联反应的作用。
2.出血性疾病与miRNA
血友病（hemophilia）除甲、乙、丙三型外，加上后来又发现的一种vWF因子（vonwillibrand factor）缺乏的血管性假血友病，共构成血友病的四种类型。越来越多的研究表明，miRNA通过与编码参与凝血的蛋白质的mRNA相互作用，起止血系统调节剂的作用。miRNA的失调可导致凝血蛋白的表达异常，从而导致出血性疾病或血栓形成。
2.1 血友病
血友病（甲HA、乙HB）属于X连锁隐性遗传，主要是由于F8和F9基因的遗传变异，进而引起凝血因子VIII和IX的缺乏引起。血友病丙型又称因子Ⅺ缺乏症或血浆凝血活酶前质(PTA)缺乏症。约0.6％的重度HA，2.9％的轻中度HA及1.1％的轻中度HB患者中，F8和F9基因未发生突变，但仍表现出较低水平的凝血因子VIII和IX表达，说明可能还受到基因遗传突变以外的机制控制。
甲型血友病通常与F8基因突变有关，但miRNA也在FVIII缺乏中起到一定的作用。通过对15个HA病人的芯片测序发现，HA患者中miR-1246，miR-4521和miR-181d表达上调，并通过Target Scan预测发现miR-1246在FVIII的3'UTR中具有潜在的结合位点，进而通过调控F8基因影响淋巴母细胞中FVIII的表达量；通过对HA病人进行高通量测序发现了8个miRNA的失调，包括2个miRNA（miR-128和let-7i）下调，6个miRNA（miR-144，miR-374b，miR-30c，miR-6803，miR-15b和miR- 483）上调，且miR-374b，miR-30c也被证明靶向FVIII的3'UTR，并调节淋巴母细胞中F8基因的表达，下调淋巴母细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的FVIII蛋白水平，并通过抑制HUVEC细胞系中miR-30c的表达导致内源性FVIII显着增加。此外，F8基因3'UTR中的部分突变，与miR-26a-5p，miR-26b-5p和miR-1297靶点十分靠近。综上，控制miRNA的表达可以调节细胞中FVIII蛋白水平，可能部分解释了未发生F8基因突变的HA患者凝血因子表达下降的原因。
乙型血友病与miRNA的研究十分有限，但是发现相比于HA病人的凝血因子VIII，HB病人中凝血因子IX的3'UTR多态性更为常见，可能存在部分失调的miRNA影响HB患者的FIX水平。最近的研究表明，miR-128和miR-125可能与F9基因中E7a (nt 34 G > T)、 E7b (nt 52 G > T )的无义突变有关。
丙型血友病，又被称为XI因子（FXI）缺乏症，其缺乏通常不引起自发性出血，而是增加止血过程中的出血风险，最近的研究表明：F11基因表达受miRNA调控。肝细胞系HepG2中，miR-181a的过表达或抑制导致FXI失调，并通过生信研究以及luciferase体外研究中发现，miR-181a与F11基因3'UTR有关，且F11 mRNA水平与miR-181a水平成显著负相关。有关FXI遗传调控的另一项研究中，预测包括miR-145和miR-181a在内的11种miRNA可能是FXI的转录后调控因子，并通过luciferase进一步证实了miR-145和miR-181a与F11 3'UTR的直接相互作用。
2.2 血管性假血友病
由Von Willebrand因子（VWF）基因突变引起的血管性假血友病（VWD），是最常见的遗传性凝血障碍，与VWF基因的560多个突变和217个多态性有关。VWF基因5'和3'UTR区的多态性已经有所研究，但尚未研究miRNA对在VWD中的影响。一项针对115位糖尿病患者和112位健康捐献者的血液样本的研究发现，与健康对照组相比，高血糖水平与VWF水平升高和miR-24表达降低有关，并通过生信研究预测和luciferase体外研究中发现，VWF的3’UTR存在miR-24结合位点，并通过糖尿病小鼠模型和内皮细胞进一步证实，抑制miR-24可增加VWF的表达，而抑制miR-24则可降低WVF的表达。另一项研究发现，miR-24与骨肉瘤（OS）组织中VWF的3'UTR相关，miR-24在人OS组织中的表达降低影响着肿瘤转移和OS细胞进程。
3.血栓形成与miRNA
血栓形成可能在静脉或动脉中发生，这种复杂的疾病与环境和遗传因素有关。此外，miRNA在血栓形成中也起到一定的作用。
3.1 静脉血栓
静脉血栓是在静脉血流迟缓，血液高凝状态及血管内膜损伤条件下，静脉发生急性非化脓性炎症，并继发血栓形成的疾病，包括深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE）。
miRNA表达差异与静脉血栓形成存在很强的相关性。大多数与DVT形成有关的miRNA，被证明由内皮祖细胞（EPC）表达，miRNA可能影响其迁移至外周循环并分化为成熟内皮细胞能力的骨髓衍生细胞的过程。研究发现，Mir-483-3p在DVT病人中显著上调，并下调血清反应因子（SRF）的表达，进而减少EPC的迁移和管型形成，促进凋亡。miR-21直接影响编码Fas配体的FASL 3’UTR，诱导细胞凋亡，且miR-21的低表达与复发性DVT和血栓后综合征（PTS）的增加相关。控制SRC激酶信号抑制剂1（SRCIN1）表达的miR-150被证明与EPC的增殖有关，miR-150的过表达引起SRCIN1的表达下调，促进深静脉血栓小鼠模型中的血栓消退，并促进EPC的血管生成和增殖。miR-126通过靶向PIK3R2基因，影响PI3K / Akt信号传导，进而调控内皮祖细胞的进程。miR-126的过度表达促进体外EPC的迁移和促肾上腺管生成，体内EPC的归巢和血栓消融。并在miR-205中观察到相似的现象，miR-205具有PTEN基因3'UTR的结合位点，进而影响Akt自噬途径与MMP2表达。此外，研究表明，深静脉血栓形成与炎症过程的改变有关，包括细胞因子，趋化因子和白细胞。miRNA是控制炎症的关键基因调节剂。从DVT患者获得的外周血单个核细胞（PBMC）中发现，白细胞介素6（IL-6）水平升高，刺激了静脉血栓形成，并与miR-338-5的低表达有关。对81位下肢深静脉血栓形成患者的血浆进行研究发现，miR-103-3p表达降低与趋化因子C-X-C模体配体12（CXCL12）表达升高有关。有研究观察到miR-26a在DVT患者中下调，可能与其靶向并抑制蛋白激酶Cδ（PRKCD）的表达，从而显着降低趋化因子C-C模体配体（CCL）2的水平，从而抑制核因子κB（NF-κB）信号通路的激活。
在肺栓塞中，通过研究78例急性肺栓塞（APE）患者和70例健康对照miR-27a / b表达发现，miR-27a / b在APE患者中显著升高，miR-27a / b靶向并调节内皮细胞中的组织因子途径抑制剂（TFPI），进而间接调节组织因子（TF）和凝血过程。相似的研究发现，APE患者的miR-134和miR-221及miR-28均上调。在10例慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者种，发现下调的let-17b直接靶向内皮素-1（ET-1）并引起肺动脉内皮细胞功能障碍。在急慢性PE患者的比较重，miR-1233在急性PE中被选择性上调。
3.2 动脉血栓
动脉血栓 (AT) 是由脂质和巨噬细胞积聚在动脉壁后形成的动脉粥样硬化斑块破裂引起的，造成的局部动脉狭窄及栓子脱落形成的游离血栓直接导致心、脑等脏器的缺血性损害。动脉血栓形成的发病机制很复杂，与动脉粥样硬化和血栓形成相关的遗传及环境因素以及两者的相互作用有关。miRNA参与了包括脂质稳态，信号传导途径和内皮功能的动脉粥样硬化过程，调节其进展、调控相关的蛋白表达。
血小板数量和活化与动脉血栓形成和冠状动脉疾病有关。在原发性血小板增多症（ET）患者中发现，miR-10a，miR-28，miR-126，miR-155，miR-221，miR-222，miR-223和miR-431显著下调以及miR-9和miR-490的上调，其中miR-223的增加与脂质代谢和高细胞内胆固醇水平有关，进而引起血脂代谢相关疾病，包括肝脂肪变性和动脉粥样硬化。有关冠状动脉疾病（CAD）的研究发现，高水平的miR-126与高水平的低密度脂蛋白相关，miR-126通过与miR-221 / 222在内皮细胞中进行动脉重塑，通过与血管细胞粘附分子1（VCAM-1）结合，miR-126可以调节白细胞与内皮细胞的粘附，从而发挥抗炎作用。在不稳定型心绞痛患者中miR-19b可以靶向组织因子，可能起到抗血栓形成的作用。miR-181b通过靶向凝血酶激活的NF-κB信号间接调控动脉血栓形成。此外，单核细胞中miR-124a和miR-125a的低表达以及miR-146a和miR-155的高表达，与抗磷脂综合征和系统性红斑狼疮的动脉血栓形成有关。主动脉瓣狭窄患者中，发现miRNA-21，miRNA-126-3p和miRNA-222的升高。
4.凝血级联反应与血栓形成
多数研究表明，miRNA的下调会导致凝血因子的表达增加，并触发血栓事件。一项对加拿大近万人有关凝血因子的研究中，显示F2，F8和F11基因的3'UTR中的部分突变与该基因产生的血浆活性增加有关，这些突变可能会干扰部分miRNA的结合位点，如F8的3'UTR内的1个突变阻碍了miR-34a / c和miR-449a / b的结合，而F11的3'UTR的6个突变阻碍了miR-554的结合。
miR-223由凝血酶活化的血小板外泌体释放，对于调节动脉粥样硬化和内皮细胞的形成至关重要。miR-223可能通过抑制组织因子，进而控制动脉粥样硬化斑块破裂的过程。在HUVEC细胞和小鼠中，miR-223的过表达或抑制导致mRNA和蛋白质水平的组织因子失调。且miR-223通过NF-κB和MAPK途径，调节外泌体中细胞间粘附分子1（ICAM-1）的表达。miR-27a / b和miR-494作用于组织因子途径抑制剂的3'UTR，并下调MCF7细胞（人乳腺癌细胞）中的TFPI mRNA和蛋白水平。这些miRNA的过表达诱导了凝血因子生成增加，促进了血栓疾病的形成。此外，纤维蛋白原α（FGA）基因的多态性被证明与静脉血栓栓塞有关。FGA基因3'UTR处存在28 bp的插入缺失，生信分析预测此处是miR-759的结合位点，并通过内源性表达FGA的肝癌细胞系HepG2的研究表明，miR-759调节FGA的表达。
纤维蛋白原（FI）水平的降低可能与miRNA介导的调节有关。炎症反应会通过白介素6（IL-6）促进纤维蛋白原的合成，miR-18a已显示出可促进IL-6介导的肝细胞内纤维蛋白原肝血红蛋白的产生。在Huh7肝癌细胞中，鉴定出27个在肝脏中表达的miRNA，被证明与调节纤维蛋白原有关，并通过luciferase实验验证miR-29a，miR-29b，miR-29c通过不结合于FI的3’UTR的方式，调节调节FI表达。一项对败血症患者凝血异常的血样研究中，发现miR-122的上调与纤维蛋白原水平升高之间存在相关性。
其他与凝血因子相关的蛋白也被证明被miRNA调节。通过RNA pull-down实验鉴定出150个miRNA与促凝（F7，F8，F11，FGA，FGG和KLKB1）和抗凝（SERPINA10，PROZ，SERPIND1和SERPINC1）以及纤溶蛋白（PLG）基因相关，并验证了其中40个。对特发性血友病的遗传分析鉴定出miR-126-3p，miR-885-5p，miR-194-5p和miR-192-5p通过靶向凝血途径中编码蛋白质的基因影响静脉血栓形成，miR-885-5p和miR-195-5p与蛋白S和FVII的表达相关。MiR-192-5p失调与FVII和ADAMS13相关，而miR- 126-3p与FXI相关。蛋白质S缺乏会诱发血栓，miR-494通过直接与3'UTR结合，下调肝Huh细胞中的PROS1（编码蛋白S）和蛋白S（PS）水平。对严重创伤性凝血病（TIC）患者的研究表明，因子FX的降低与miR-24失调有显著关联。
评论
出血性疾病和血栓形成都是由于凝血系统动态平衡的紊乱而引起的，并涉及许多分子的共同参与，如miR-145，miR-320a / b和miR-222等。在本篇文章中，作者对直接或间接影响凝血和/或血栓形成相关的miRNA，进行了综述。常见的出血性疾病包括甲乙丙型血友病和VWD。对于部分F8和F9基因编码区和非编码区未发生突变的情况，作者从miRNA失调的角度解释可能是疾病表现的原因。使用生信研究或实验方法，发现多种miRNA与编码凝血因子的基因的3'UTR相关，且miRNA与基因是一对多、多对一的关系。此外，作者回顾了miRNA在血栓形成中的作用。静脉血栓栓塞，深静脉血栓形成，肺栓塞和动脉血栓形成均与miRNA失调有关。并阐述了与凝血级联反应相关基因的miRNA。总之，了解miRNA在血栓形成中的作用，并通过进一步的研究来明确调控机制，确定部分miRNA充当特定诊断预测指标是十分有价值的。
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