Nature综述 ∣ 单细胞测序技术在狼疮性肾炎肾脏免疫细胞中的设计与应用
编译：Echo，编辑：十九、江舜尧。
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狼疮性肾炎所致的组织损伤一直是公认的世界性难题，但随着单细胞RNA-seq技术的不断发展与革新，使得临床肾脏活检中细胞群的详细特征得以逐渐揭示。与此同时，低温肾脏活检标本保存的方法不断完善保证了细胞的完整性和活性，使得样本在收集方面可以相对灵活开展。目前已开始对存在于狼疮性肾炎患者浸润性细胞、固有细胞和实质细胞展开一系列单细胞层面的研究，将这些方法用于狼疮性肾炎患者的活检标本中，同时这些方法也可以广泛应用于多种炎症性肾脏疾病，有望在未来极大地拓展我们对肾脏炎症的深入理解和认识。
论文ID
原名：Design and application of single-cell RNA sequencing to study kidney immune cells in lupus nephritis.
译名：单细胞测序技术在狼疮性肾炎肾脏免疫细胞中的设计与应用
期刊：Nature Reviews Nephrology
发表时间：2019.12.18
影响因子：19.684
通讯作者：Betty Diamond
通讯作者单位：美国范斯坦医学研究院
DOI号：10.1038/s41581-019-0232-6.
介绍
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多器官受累的自身免疫性疾病，严重时可危及生命。狼疮性肾炎是一种常见而严重的SLE合并双肾不同程度的免疫类型损害，其发病与免疫复合物的形成、免疫细胞异常密切相关。临床表现主要为SLE所致的全身表现外伴有血尿、蛋白尿、水肿、肾功能急剧下降等。临床数据表明至少有50%的SLE患者会发展为狼疮性肾炎，其中10%的狼疮性肾炎患者在5年内可发展为终末期肾脏病(ESRD)。虽然随着治疗手段的不断优化调整，但狼疮性肾炎的治疗进展趋于缓慢，临床试验在狼疮性肾炎失败率较高，尽管有许多因素可以解释这些结果，但以下三点相对最为重要。（1）我们目前对狼疮性肾炎的分类，以及在临床试验中对患者的纳入或排除的确定，与我们对狼疮性肾炎的预后和进展的认识不一致。（2）我们目前的临床评估并不总是准确反映肾脏病理的潜在变化。（3）我们选择狼疮性肾炎的治疗靶点是基于疾病发病机制的概念，这些概念来自于小鼠模型和血液分析，而不是肾脏。在这篇综述中，作者讨论了在实施狼疮性肾炎免疫细胞的单细胞RNA-seq分析时的方法和临床设计的考虑。诸多研究表明从单细胞RNA-seq分析狼疮性肾炎肾脏和尿液，包括免疫细胞群的确定可能有助于改变狼疮性肾炎的治疗。鉴于目前正努力使用单细胞RNA-seq来研究多种肾脏疾病，包括糖尿病肾病和移植排斥反应等，这将对不同疾病的互相比较具有重要意义。
结果
1、狼疮性肾炎的单细胞RNA-seq研究的实验设计与应用
目前狼疮性肾炎组织学评估的一个主要局限性是肾脏中免疫细胞的特征非常有限，几乎没有收集到关于特定免疫细胞亚群或其功能分子表达的信息。利用RNA- seq进行全转录分析，可以对组织样本中的基因表达进行全基因组范围的量化，现在可以应用于组织内的单个细胞。大体积肾组织的转录组学分析为狼疮性肾炎肾损伤机制的研究提供了一些思路。另一项独立的对不同肾脏疾病(包括狼疮性肾炎)患者的肾活检样本进行的转录组研究发现，表皮生长因子(EGF)基因表达降低与eGFR降低之间存在关联。例如，激光捕获显微术通过肾小球和间质组织单独的收集有助于识别影响肾脏不同部位的通路和作用。虽然对大块组织的转录组学研究已经提示一些狼疮性肾炎发病机制中的关键免疫通路，但这些对完整组织的分析并不能提供识别哪些细胞群对观察到的基因表达通路改变贡献最大所需要的分辨率。因此，单细胞RNA-seq技术成为了更好地选择，因为它建立了狼疮性肾炎肾脏中所有细胞的目录。该目录可以为后续的研究分析提供信息，小鼠和人类肾脏的单细胞转录组分析已经证明了这种方法的可行性和应用前景。
（1）肾脏组织样本的收集和处理
试图建立广泛的狼疮性肾炎转录组分析的研究需要应对与组织收集和处理相关的多个挑战。如图1所示为临床活检病人肾脏组织从样品采集到结果分析的流程图。不同于组织学分析的标本，由于大多数单细胞RNA-seq方法需要完整的活细胞进行分析，因此需要新鲜的组织标本。采集后，需要对组织样本进行处理，获得单细胞悬浮液进行单细胞RNA-seq分析，快速处理使转录活性基因的表达变化最小化。包括处理时间、培养温度和分离条件在内的多个变量可以改变分离细胞的转录组。因此，优化组织样品的处理是一个非常重要的步骤。在将组织分离成单个细胞后，从死细胞和碎片中纯化完整的活细胞是非常必要的，可以通过磁分离方法或流式细胞术分选功能来实现。单细胞核RNA-seq是另一种RNA-seq方法，将细胞核从细胞中分离出来进行测序，该方法适用于完整的冷冻组织样本，避免了组织分离的挑战和活细胞分离的要求。尽管用单细胞核RNA-seq检测到的转录本数量通常低于用单细胞RNA-seq检测到的转录本数量，但迄今为止的数据表明，两种方法在肾活检样本中检测到的基因数量相似。
（2）质量控制的指标
确定提供高质量的单细胞转录组数据的细胞数量并不是很简单，认为适合分析的细胞数量取决于使用的质量指标和阈值。单细胞RNA-seq的质量控制指标通常包括每个细胞检测到的基因数量的阈值和与线粒体基因对应的reads比例。RNA的产量和质量可能会因为细胞类型的不同而不同，例如，白细胞通常表现出良好的生存能力，而健康的实质细胞则相对难于分离和研究。
（3）对照组肾组织的获取
对于侧重于比较不同肾脏病理或疾病进展阶段的研究，从具有相关疾病的患者组获得的样本之间的比较可能就足够。然而，健康的肾组织纳入解决了一个额外的问题那就是关于肾脏有无病理差异的问题，有以下方法可以获得健康的肾脏组织。例如，正常的肾脏组织可以从手术标本中分离出来或者从活体肾脏组织获取作为对照组织。
（4）疾病的异质性
在研究狼疮性肾炎的细胞特征时，应考虑多种临床特征，包括肾小球肾炎的组织学分级、患者的性别、种族、药物治疗和全身疾病活动等，狼疮性肾炎的国际肾脏协会分类包括六种明确的病理状态。狼疮性肾炎肾脏的细胞分析为深入了解疾病的分子途径和细胞类型，以及识别可预测的生物标志物提供了可能（如图2所示）。纳入的人群在人口统计学特征、疾病表现和药物治疗方案方面可能具有很大的异质性，这意味着一些患者亚群将包括的个体将会很少，对于这些患者亚群，可能无法准确的评估来自肾脏的单细胞转录组数据与其他患者亚群的数据有何不同。
图2. 对于肾脏免疫病理的细胞分类。对肾脏组织进行详细的单细胞分析可以更精确地定量存在于狼疮性肾炎肾脏中主要的免疫细胞和实质细胞表型，识别和检测这些细胞群或通路可能改善患者分层，为更精确地选择直接针对相关细胞类型的治疗方法，并更好地监测治疗所带来的反应提供帮助。
2、狼疮性肾炎的研究进展概况
（1）狼疮性肾炎的白细胞亚群
狼疮性肾炎肾活检标本的组织学和大量转录组数据分析表明，淋巴细胞的浸润与肾功能降低和预后不良密切相关。用流式细胞仪分离纯化免疫细胞，分析狼疮性肾炎肾脏的免疫细胞划分。对狼疮性肾炎肾脏中存在的免疫细胞与健康肾脏组织的转录谱综合评估，开始解决关于参与狼疮性肾炎的免疫机制及其临床意义等多个问题。在狼疮性肾炎肾脏中共发现21个免疫细胞亚群，虽然所分析的细胞总数相对较少(约2700个白细胞)，饱和分析表明，增加分析的患者数量不太可能发现新的细胞类别。这些观察结果开始确定狼疮性肾炎中导致免疫损伤的细胞群（如图3所示）。
（2）肾脏中浸润细胞与血细胞的比较
在狼疮性肾炎的小鼠模型中，肾脏和肾脏细胞中缺乏某些循环细胞亚群。例如，我们发现组织内的巨噬细胞群在血液中没有对应产物。开发能够促进血液单核细胞分化为肾脏中新的激活状态的方案现在是至关重要的，因为这可能使这些细胞的功能分析成为可能。
（3）单细胞RNA-seq的数据和机理分析
研究结果表明在狼疮性肾炎患者的肾脏中几乎所有血源性细胞群CXC趋化因子受体4(CXCR4)均有表达，除了两个白细胞亚群外，其余所有亚群的表达均大于50%。 CXCR4的配体CXCL12主要在活化的巨噬细胞表达，虽然巨噬细胞可能是由肾上皮细胞产生的，但在肾脏内似乎会发生分化。从单细胞RNA-seq数据中得出的一个重要结论是，尽管不同白细胞群的相对比例有所不同，但在多个患者样本中发现了许多相同的细胞群。
（4）单细胞RNA-seq的局限性和下一步计划
目前可用的RNA-seq数据提供了一个框架来定义狼疮性肾炎肾脏的免疫细胞群，但这些分析仅仅才是一个起点。来自重复活检样本的数据可能提供关于转移方向性的令人信服的信息，因为在治疗期间获得的用于测序的活检中可能缺少一个子集。重复活检可能通过识别对治疗反应改变的细胞亚群来识别重要的治疗靶点。在将来可通过以下几个方面来进行研究并值得深入思考如随着时间的推移，细胞类型和临床特征之间的关系、浸润的免疫细胞与肾脏固有细胞的关系、细胞特征未被单细胞RNA-seq所捕获、免疫细胞表型的病理意义几个方面着手考虑。
结语与展望
狼疮性肾炎肾脏单个细胞的全转录组分析显著提高了我们对狼疮性肾炎免疫细胞如髓细胞、T细胞、B细胞等浸润程度的认识，在开展这些研究时，优化组织收集、处理和分析的方案对于确保高质量数据的产生和降低批次的变化至关重要。与此同时，还需要仔细考虑患者的选择纳入标准，在数据分析时必须考虑疾病的异质性和性别等复杂因素。虽然在处理单细胞RNA-seq数据时存在一定的局限性，但将这些方法应用于狼疮性肾炎患者以及其他肾脏疾病患者，可能对临床的预后观察和治疗反应指标具有积极影响。未来的研究应该关注肾脏白细胞浸润的成分、肾脏中特定白细胞群体的转录组特征以及是否与肾脏疾病的进展相关联。总之，在狼疮性肾炎患者中，对肾脏固有的细胞以及浸润细胞的单细胞RNA-seq分析是获取信息的重要手段，对疾病和组织损伤预后的分子标志物筛选具有重要意义。
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