一作解读 | Advanced Science 野生大麦微环境适应性驱动同域物种形成
近日，西北农林科技大学宋卫宁教授团队在国际知名期刊《Advanced Science》（中科院一区top，IF: 15.84）上在线发表了题为“Genomic and Phenotypic Divergence in Wild Barley Driven by Micro-geographic Adaptation”的研究文章。西北农林科技大学已毕业博士生卞建新、江西农业大学青年教师崔立操为论文共同第一作者，西北农林科技大学聂小军副教授、宋卫宁教授为共同通讯作者，西北农林科技大学为第一完成单位。
编者按：前几日，我们对该研究进行了通讯报道《Advanced science | 西北农林科技大学宋卫宁教授团队在适应性进化和物种形成领域取得重要进展》，今天邀请第一作者进行了更加详细的解读，希望能够对大家提供更好的帮助。
研究背景
微地理环境（Microgeographic）一词最早可以追溯到20世纪40年代(Eplingand Dobzhansky, 1942)。尽管该词已经被使用了70多年，但在实际研究中考虑到较高的基因流会减少适应性差异的产生，大多数的适应性研究是在一个相对较大空间尺度上进行的，因此其缺乏明确的量化定义。Richardson等（2014）将微环境适应性定义为：“微环境适应性是指在特定的空间尺度上发生的局部适应的一种特殊情况，在这种情况下，种群之间会存在较高的基因流”(Richardsonet al., 2014)。可以说，这一概念与达尔文提出的“同域物种形成”理论殊途同归，即：在没有地理隔离的种群间，虽然存在着较高的基因交流，但是由于存在宿主选择差异、食物选择差异或生境选择差异，同一种群仍可产生适应性分化，产生生殖隔离，并最终导致新物种的形成。
另外，对于植物来说，由于其具有固着生长的特点，因此土壤因素成为仅次于气候的决定植物分布的主要因素。土壤是由各种物理、化学及生物元素组成，一旦这种组成基质发生不连续性排列时，就有可能造成物种适应性发生变化进而导致新物种的形成。另外，有研究表明，对于一些极端差异的土壤（如：蛇纹岩、矿尾等），群体的适应性分化甚至可以在几个世代之内产生(Antonovicset al., 1971; Al-Hiyaly et al., 1993)。因此，探究微环境下群体适应性进化不仅对于研究自然选择在物种进化及演化过程的作用具有重要意义，而且为“同域物种形成”理论提供了有力的证据支持。
1.土壤组成差异为探究微环境适应性进化提供重要条件
基于此，我们选取了地理位置紧邻的、以火山岩(Basalt)和石灰岩(Chalk)为主要地质成分组成的微地理区域。该区域是典型的地中海气候，由于地理位置紧挨着且中间没有地里隔离，因此气候因素在塑造物种适应性进化时并不会有太大的作用，而土壤组成则是造成物种适应性进化的最主要动力。因此，我们首先利用X射线荧光元素分析仪(EA1200VX)对Basalt和Chalk土壤组成进行了测定，通过显著性分析发现，两种土壤在多种元素组成存在显著性或极显著地差异，例如Ca2 、Al 3 、Fe 3 等。特别的，Chalk土壤中Ca2 含量大约是Basalt土壤的8.39倍，由此我们可以推断，Chalk群体为了维持正常的生命活动，一定进化出了一套特殊的钙离子平衡机制。因此，该区域为我们探究微环境适应性驱动“同域物种形成”提供了良好的条件及模型。
2.表型差异证实群体微环境适应性进化已经形成
本研究中的两个野生大麦群体由宋卫宁老师于2013年采样。在温室和田间调查发现这两个野生大麦群体间有许多形态和农艺性状上的显著差别。基于田间农艺性状结果分析我们可以得知，这两个野生大麦群体之间的表型差异是由遗传因素造成的。
另外，对于探究群体的本地适应性来说，生态学上常用的研究方法除了同质园实验外，还包括相互移植实验（Reciprocal transplant experiment），即通过改变同一种群的生存环境，比较其表现型是否在原始环境中表现出更好的适应性。因此，为了进一步证实这些表型差异是由于对不同土壤适应性造成的，我们对这两个群体进行了相互移植实验。为了保证实验的准确性，该实验由宋卫宁教授专程远赴以色列与合作伙伴完成。实验点距离采样地的直线距离为30km，因此保证了气候条件与采样地的一致性；实验所用土壤均为采样地采集，进而保障了土壤因素的可靠性。对照实验设置为将同一群体种植到原始土壤以及对方土壤中。通过性状调查，比较分析群体各性状在原始生境以及对方生境中的表现。结果显示：两种野生大麦在绝大多数性状上均表现出在原生境下优于生长在对方生境的结果。该结果非常完美的诠释了适应性进化的概念，证实了两个大麦群体之间的表型差异是由于适应性进化造成的。
3.全基因组水平变异证实群体适应性分化
接下来，为了探究群体之间的遗传分化，我们利用全基因组重测序技术对两个群进行了测序分析。全基因组重测序结果发现：两个群体之间的SNP数目达到了57.24M, Indel数目为3.38M，表明了两个群体之间存在着了较高的遗传差异。
基于系统进化树、主成分分析我们可以看到两个群体可以明显的分为两个独立的种群，且Basalt群体之间的遗传距离明显的大于Chalk群体。连锁不平衡结果表明Chalk群体之间具有更高的连锁程度，暗示了其更高的重组率。另外，群体结构还发现，两个群中均存在着杂合遗传背景的品系，结合种群动态分析发现，这两个群体最早起源于同一个祖先群体，约在3.25万年出现了分化，并且在末冰期前后存在着不同的迁移率，这一结果也证实了这两个群体之间存在着基因交流。全基因组重测序结果表明两个群体之间已经形成了非常明显的适应性分化，这一结果为微环境适应性驱动同域物种形成提供了基因组水平的依据。
4.选择性消除分析鉴定关键候选基因
为了进一步探究在群体适应性进化中的发挥重要作用（受选择）的基因，我们利用vcftools 对两个群体进行了Fst和Tajimas’D分析来确定受选择区域并基于注释信息确定了候选基因。另外，为了缩小候选基因的范围以及提高准确性，我们利用群体转录组测序对来自两个群体共计60个样本（根和叶）进行了测序及差异表达分析。通过同源比对水稻已知功能基因，找到一系列具有重要功能的候选基因，如与离子转运、重金属解毒、开花期以及根系形态等相关基因，另外，通过单倍型分析发现部分基因在两个群体中具有完全不同的单倍型，这一结果也表明两个群体在适应不同的生境是已经产生了明显的遗传分化。
另外，由于植物固着生长的特性，根系作为土壤的直接接触者，在这一过程中理应受到了最大的选择压力。因此，根系表型差异应该会更为明显，为了验证这一推断，我们利用水培方法对两个群体的根系形态进行调查分析，发现两个野生大麦具有完全不同的根系形态，Basalt野生大麦表现出细长、次生根少，而Chalk野生大麦表现为粗短、次生根多的表型。根据根系形态差异我们推断，这是由于适应不同土壤环境造成的，火山岩土壤由于其营养物质丰富，并且具有多孔的特性，因此其根系表现为细长的形态；而石灰岩由于其营养物质匮乏，保水性差，土层较薄、容易板结等特点，造成了大麦根系更加粗短而且具有更多须根系的表型。
为了进一步在分子水平上探究造成这两种根系表型差异的原因，我们参照前人在乌拉尔图小麦中通过同源基因比对及单倍型相关性分析找到控制种子长度的关键基因的方法(Ling et al., 2013)。结合根系表型、重测序分析中的受到选择基因以及群体转录组中差异表达的基因，通过同源比对，找到控制根型的关键候选基因--HvMOR基因。结构域分析发现，该基因具有LOB结构域，与水稻中的OsCrll4基因(Inukai et al., 2005)以及小麦中的TaMOR基因(Li et al., 2016)为同源基因。研究发现，过表达TaMOR基因不仅可以增加侧根的数量而且可以增大根系形态，与这两个群体的根系形态具有一致性。对该基因的单倍型分析发现，在距离ATG317bp的位置，Chalk野生大麦中发生了一个SNP变化且引起了氨基酸变化，该变化与前人在抗旱小麦长6878中的变化一致。另外，生长素可以结合生长素响应元件来诱导LBD基因表达，从而影响根系的生长发育[8]。因此，我们对该基因启动子区域（5’-UTR上游1kb区域）的生长素响应元件进行了预测和分析，结果找到7个生长素响应元件（命名为RE1-RE7）。结合转录组结果发现，该基因仅在根中表现出差异表达，且在Chalk野生大麦根中极显著的高表达。进一步分析发现， RE5有一个位点（5’-UTR上游246bp）在两个群体中具有完全不同的单倍型，且该变化仅发生在Chalk群体中，暗示了该变异在基因的差异表达中具有非常重要的作用。最后，相关性分析表明，单倍型与根系结构之间具有较高的相关性，并且与前人在小麦中的结果一致。因此，结合以上分析我们认为，该基因在调节这两个群体适应性进化过程中的根系形态中发挥着关键的作用。
总的来说，该研究结果不仅为微环境适应性进化研究提供了证据支持，而且从表型以及基因组水平上较为完整的证实了同域物种形成的理论的科学性，并通过对关键受选择基因的挖掘，为栽培大麦的遗传改良提供了重要的基因资源。
主要参考：
Al-Hiyaly, S. A. K.,McNeilly, T., Bradshaw, A. D., and Mortimer, A. M. (1993). The effect of zinc contamination from electricity pylons. Genetic constraints on selection forzinc tolerance. Heredity (Edinb). 70:22–32.
Antonovics, J.,Bradshaw, A. D., and Turner, R. G. (1971). Heavy Metal Tolerance in Plants. Adv. Ecol. Res. 7:1–85.
C. Darwin, L. Kebler, On the origin of species by means ofnatural selection, or, The preservation of favoured races in the struggle forlife. (J. Murray, London, 1859), pp.ix, 1 , 502 p.
Epling, C., andDobzhansky, T. (1942). Genetics of Natural Populations. VI. Microgeographic Races in Linanthus Parryae. Genetics 27:317–31732.
Feng, Z., Sun, X.,Wang, G., Liu, H., and Zhu, J. (2012). LBD29 regulates the cell cycle progression in response to auxin during lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Ann. Bot. 110:1–10.
Inukai, Y., Sakamoto,T., Ueguchi-Tanaka, M., Shibata, Y., Gomi, K., Umemura, I., Hasegawa, Y.,Ashikari, M., Kitano, H., and Matsuoka, M. (2005). Crown rootless1, which isessential for crown root formation in rice, is a target of an Auxin Response Factor in auxin signaling. Plant Cell 17:1387–1396.
Li, B., Liu, D., Li,Q., Mao, X., Li, A., Wang, J., Chang, X., and Jing, R. (2016).Overexpression of wheat gene TaMOR improves root system architecture and grain yield in Oryza sativa. J. Exp. Bot. 67:4155–4167.
Ling, H. Q., Wang, J.,Zhao, S., Liu, D., Wang, J., Sun, H., Zhang, C., Fan, H., Li, D., Dong, L., etal.(2013). Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticum urartu. Nature. 496:87–90.
Richardson, J. L.,Urban, M. C., Bolnick, D. I., and Skelly, D. K. (2014). Microgeographic adaptation andthe spatial scale of evolution. Trends Ecol. Evol. 29:165–176.
小麦族多组学网站：http://202.194.139.32