Western-blot（WB）实验步骤有哪些？

B通常广泛用于检测复杂样品中的少量目的蛋白，或监测蛋白表达与纯化。它通常被认为是评估新抗体及其蛋白检测分析方法（如ELISA）的标准之一。WB的主要步骤大致分为以下三步：SDS-PAGE分离蛋白样品、蛋白样品转移至膜上以及鉴定膜上的目的蛋白。

根据WB的这几大步骤，我们总结出一个成功的WB需要具备大致四个要求：

1.蛋白样品的分离及洗脱。一个复杂的蛋白样品在凝胶电泳中根据其分子大小分离，之后在转移过程中从凝胶上洗脱，如果仍保留在凝胶上则影响WB实验；

2.吸附于膜。蛋白从凝胶上洗脱后吸附于膜上，转移时电极方向、转移时间、膜的处理等都将影响蛋白的吸附；

3.实验过程中蛋白的截留，在转移后的后续处理过程中蛋白持续吸附于膜上，过分冲洗等做法都将导致蛋白脱落；

4.在实验过程中，吸附的蛋白样品能直接与其检测试剂接触，比如不适当的封闭等操作将使蛋白样品被掩蔽，无法得到WB结果。

因此，在WB的实际操作中都应注意以上要求为前提进行，以期得到良好的**印记。