乳酸菌检验及视频分享
近期，很多网友在后台留言咨询一些标准上的问题，小编综合看了一下，发现大多数问题纠结在找不到国标或者不知道选用哪个标准合适，还有部分是因为国标看的不够仔细导致操作上有些疑惑，于是小编决定针对大家后台的留言，会陆续整理相关检测知识分享给大家。欢迎大家踊跃后台给小编留言~
一、乳酸菌的相关现行标准
1.GB 4789.35-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验
2.GB/T 5009.186-2003 乳酸菌饮料中脲酶的定性测定
3.QB/T 4575-2013 食品加工用乳酸菌
4.DB12/T 862-2019 水产微生态制剂 乳酸菌生产技术规程
5.QB/T 5165-2017 食品用乳酸菌鉴定技术指南
6.DB37/T 3233-2018 饲料原料 乳酸菌发酵豆粕
7.DB15/T 1454-2018 苜蓿青贮乳酸菌添加剂使用技术规范
8.DB44/T 1136-2013 饲料中乳酸菌活菌的检验方法
二、国标详情
1.范围
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌( lactic acid bacteria)的检验方法。
本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。
2.术语和定义
2.1 乳酸菌 lactic acid bacteria
一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属( Lactobacillus)、双歧杆菌属( Bifidobacterium)和链球菌属( Streptococcus)
3.设备和材料
除做微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
3.2 冰箱:2℃~5℃。
3.3 均质器及无落均质袋、均质杯或灭菌乳钵。
3.4 天平:感量0.1g。
3.5 无菌试管:18mm×180mm、15mmx100mm。
3.6 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
3.7 无菌锥形瓶:500mL、250mL
4.培养基和试剂
4.1 MRS( Man Rogosa Sharpe)培养基及莫匹罗星锂盐( Li-mupirocin)改良MRS培养基:见附录A中A.1。
4.2 MC培养落( Modified Chalmers 培养基):见附录A中A.2。
4.3 0.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.3。
4.4 0.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.3。
4.5 0.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.3。
4.6 0.5%甘露醇发酵管:见附录A中A.3。
4.7 0.5%水杨苷发酵管:见附录A中A.3。
4.8 0.5%山梨醇发酵管:见附录A中A.3。
4.9 0.5%乳糖发酵管:见附录A中A.3。
4.10七叶苷发酵管:见附录A中A.4。
4.11 革兰氏染色液:见附录A中A.5。
4.12 莫匹罗星锂盐(Li- Mupirocin):化学纯。
4.13 半胱氨酸盐酸盐(Cystcinc llydrochloride) :纯度>99%。
5.检验程序
6.操作步骤
6.1 样品制备
6.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
6.1.2 冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻，时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的条件解冻,时间不超过15min。
6.1.3 固体和半固体食品:以无操作称取25g样品,置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min~1000r/min均质1min~2min,制成1：10的样品匀液；或置于225mL生理量水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10的样品匀液。
6.1.4 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL数入有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分摇匀,制1：10的样品匀液。
6.2 步骤
6.2.1 用1mL无吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。
6.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
6.2.3 乳酸菌计数
6.2.3.1 乳酸菌总数
6.2.3.2 双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移人平皿后,将冷却至48℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基倾注人平皿约15 mL,转动平皿使混合均匀。36℃士1℃厌氧培养72 h士2 h,培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15 min内完成。
6.2.3.3嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移人平皿后,将冷却至48℃的MC培养基倾注人平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。36℃士1℃需氧培养72 h士2 h,培养后计数。嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径2mm±1mm,菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在15mim内完成。
6.2.3.4 乳杆菌计数
根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃的MRS琼脂培养基倾注人平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。36℃士1℃厌氧培养72h士2h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
6.3 菌落计数
可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位( colony-forming units,CFU)表示。
6.3.1 选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数:若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
6.4 结果的表述
6.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)中菌落总数结果。
6.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按公式(1)计算：
6.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CEU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
6.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6.4.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30FU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6.5 菌落数的报告
6.5.1 落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
6.5.2 菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数:也可用10的指数形式来表示,技“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
6.5.3 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以 CFU/mL为单位报告。
7.结果与报告
根指菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。
8. 乳酸菌的鉴定(可选做)
8.1 纯培养
挑取3个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于MC琼脂平板,乳杆菌属接种于MRS琼脂平板,置36℃±1℃厌氢培养48h。
9.2 鉴定
9.2.1 双歧杆菌的鉴定按GB 4789.34的规定操作。
9.2.2 涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状,无芽胞,革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为0.5um~2.0um,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性。
9.2.3 乳酸菌种主要生化反应见表1和表2。
GB 4789.35-2016 食品安全国家标准
食品微生物学检验 乳酸菌检验
来源：国标及国家市场家督管理局