Omics精进08|mRNA测序文库构建
本文介绍「mRNA测序文库」构建。
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mRNA文库构建主要步骤如下，
详细一点，左边为构建过程，右边为质控过程。
total RNA提取
上图黄色为残留DNA，DNA酶即可消化。
total RNA的完整度使用「RIN值」（RNA integrity number）评估，毛细电泳结果图中「18s和28s峰」越尖，「RIN越接近10表明样品完整性越高」，没有降解，下面看一张agilent官网图。
之所以关注「18s和28s」【原核生物关注「23s，16s」】，是因为total RNA中「mRNA仅仅占2%左右」，核糖体RNA（rRNA）占据95%左右，直接看mRNA是找不到峰的。
根据本人当年实验经历，也可以通过琼脂糖凝胶电泳看RNA完整性，完整性高的total RNA胶图理论上有28s，18s，8s，5s四条带【原核生物为23s，16s，5s】；高度降解的RNA只有5s一条带。
mRNA富集
「原核生物」mRNA无polyA尾巴，通过「去rRNA的方式富集mRNA」；「真核生物」mRNA有polyA tail通过「oligo（dT）磁珠富集mRNA」。
mRNA片段化
可通「过物理或者酶」切割的方式片段化mRNA。
cDNA合成
第一步，随机引物逆转录片段化mRNA为一链cDNA。
第二步，二链合成，形成双链cDNA如上图。
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「注意」，mRNA文库可区分为链特异性文库和链非特异性文库，二者构建时在二链合成步骤有很大差异，链特异性文库在二链合成时添加了dUTP。 相比之下，「链特异性文库有很大优势」，可识别RNA方向，可溯源RNA是来自基因的正义链还是反义链，这可极大「提高基因定量、可变剪切分析的准确性」。 ❞
两端加接头
添加测序接头。
PCR富集mRNA
通过PCR富集mRNA，分选出300-500bp的片段作为文库。
文库测序
Reference
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Zeng W , Mortazavi A . Technical considerations for functional sequencing assays[J]. Nature Immunology, 2012, 13(9):802-7.
Stark R , Grzelak M , Hadfield J . RNA sequencing: the teenage years[J]. Nature Reviews Genetics.
https://www.agilent.com/zh-cn/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-rna-kits-reagents/bioanalyzer-rna-analysis-228256