GST融合蛋白表达与纯化的实验步骤与注意事项

GST表达融合蛋白载体pGEX-KG大小:5006bp,氨苄青霉素抗性(Ampr),IPTG诱导表达酶切位点:BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994GST分子量:构建pGEX-KG-YFG重组 质粒1、分析所感兴趣的基因(your favorite gene, YFG)Primer Premier 5.0软件,分析YFG含有哪些酶切位点,注意是否与pGEX-KG载体 的多克隆位点有重合2、确定合适的双酶切位点NEB网站(www.neb.com) Double Digest Finder软件 ,查找最佳双酶切组合(下表)NEB 双酶切图谱BamHIEcoRINEBuffer EcoRI + BSA at 37°C.BamHI may exhibit star activity in this buffer.XbaINEBuffer 3 + BSA at 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.NcoINEBuffer 3 + BSA at 37°C.SalINEBuffer 3 + BSA at 37°CXhoINEBuffer 3 + BSA at 37°C.SmaIXbaINEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XbaI and raise temperature to 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.NcoINEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add NcoI and raise temperature to 37°C.XhoINEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add XhoI and raise temperature to 37°C.SacINEBuffer 4 + BSA at 25°C with SmaI, then add SacI and raise temperature to 37°C.HindIIINEBuffer 4 at 25°C with SmaI, then add HindIII and raise temperature to 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.EcoRINcoINEBuffer EcoRI at 37°C.SalINEBuffer EcoRI + BSA at 37°C.XhoINEBuffer EcoRI + BSA at 37°C.SacINEBuffer 1 + BSA at 37°C.EcoRI may exhibit star activity in this buffer.HindIIINEBuffer EcoRI at 37°C.XbaINcoINEBuffer 2 + BSA at 37°C.SalINEBuffer 3 + BSA at 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.XhoINEBuffer 2 + BSA at 37°C.SacINEBuffer 4 + BSA at 37°C.This buffer is not supplied with either enzyme.At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.HindIIINEBuffer 2 + BSA at 37°C.NcoISalINEBuffer 3 + BSA at 37°C.XhoINEBuffer 2 + BSA at 37°C.SacINEBuffer 1 + BSA at 37°C.HindIIINEBuffer 2 at 37°C.SalIXhoINEBuffer 3 + BSA at 37°C.XhoISacINEBuffer 1 + BSA at 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.HindIIINEBuffer 2 + BSA at 37°C.SacIHindIIINEBuffer 2 + BSA at 37°C.At least one enzyme has < 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.对照YFG、载体多克隆位点,确定上、下游酶切位点3、设计PCR上、下游引物Primer Premier 5.0软件,设计PCR上、下游引物酶切位点外最多含6个碱基3’端不是A,最好是G或C,但是不推荐使用GC或CG结尾3’端至少保证有10个碱基完全配对得分(Rating)大于70[注意]上游引物:是否添加适当碱基,确保不打乱开放阅读框下游引物:添加终止密码子(UAA、UAG、UGA)4、引物合成及保存合成:上海生工生物工程技术服务有限公司(Email:beijing@sangon.com,Tel:81767586);纯化方法:柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳?;价格1.30/碱基保存:贮存浓度:100pmol/&mu;l(100&mu;M),工作浓度:10pmol/&mu;l(10&mu;M),-20°C保存5、PCR扩增YFG模板:质粒10ng/&mu;l 稀释少量 -20°C保存引物:10pmol/&mu;l(10&mu;M) -20°C保存Taq酶:NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb反应体系(配制时置于冰上)25&mu;l反应体系50&mu;l反应体系模板1&mu;l2&mu;l上游引物1&mu;l2&mu;l下游引物1&mu;l2&mu;l2×Master Mix12.5&mu;l25&mu;l去离子H2 O9.5&mu;l19&mu;l反应条件(1) 预变性 94°C 5 min(2) 变性 94°C 30 s(3) 退火 待定 30 s(4) 延伸 72°C 待定(5) 重复2-5 25-30个循环(6) 补平缺口 72°C 10 min(7) 暂存 10°C[注意]退火温度:参考4(G+C)+2(A+T)-4(互补碱基),参考Ta Opt(Primer Premier 5.0)延伸时间:Taq酶:1kb/min循环数小于30,减少错配琼脂糖电泳检测PCR产物0.8%有效分离范围:10~0.8kb;1.0%有效分离浓度7~0.5kb50ml TAE加入5&mu;l EB母液(5mg/ml)100V,30-45min拍照或者紫外灯下切胶回收6、构建pGEX-KG-YFG酶切:双酶切PCR产物、pGEX-KG回收:PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收连接:pGEX-KG 50ng、插入片段150ng转化铺平板:Ampr挑单克隆:Ampr(四个菌落足够了)鉴定:小提质粒酶切 or菌体 PCR7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达(1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根)(2)2 ml离心管中,加入25&mu;l BL21+ 3&mu;l质粒(300-500ng),混匀(质粒&le;感受态1/10)(3)冰上放置30min(4)42°C,90s(5)冰上放置2-3min(6)加入300&mu;l LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB),37°C,250rpm,1 h(7)4000rpm,2min,弃上清,其余混匀以后涂平板(Ampr),37°C,过夜(16 h)(8)挑单克隆菌落,5ml LB(Ampr),37°C,250rpm,过夜(16 h)()稀释10倍、20倍、50倍测定OD600()选择合适的稀释倍数,5ml菌液,37°C,250 rpm,1 h,测定OD600(7)取100&mu;l菌液加入5ml LB(Ampr)(50倍稀释),37°C,250rpm,过夜(16 h)(8)取500&mu;l菌液加入5ml LB(Ampr)(10倍稀释)(其余菌液4°C保存),测OD600(9)37°C,250 rpm,2 h(OD600:0.6-0.8),测OD600(10)室温放置20 min(摇床降温,30°C)(11)取100&mu;l作为诱导前对照,冰上放置(12)菌液中加入IPTG,终浓度0.5-1 mM(13)30°C,250 rpm,2 -4h(可做时间梯度),测OD600(14)取100&mu;l作为诱导后对照,连同诱导前菌液,12000rpm,离心2min,加入50&mu;l 1×SDS上样缓冲液(15)取4ml菌液,12000rpm,离心2min,收集到2ml离心管中(16)加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体(17)超声破碎细胞:超声20s,间隔10s,共3-5次,超声强度200-300W(冰浴)(18)超声后菌液换入一个新1.5ml离心管,4°C,12000rpm,离心5min(19)超声后上清:取25&mu;l上清,加入25&mu;l 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)(20)超声后沉淀:沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬,取25&mu;l,加入25&mu;l 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存)(21)将四个样品煮沸3min,12000rpm,离心5min(22)8-10%SDS-PAGE,30&mu;l上样,顺序:诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀(23)考马斯亮蓝染色[注意](1)菌液OD值小于1即可(2)诱导时间最好做一个梯度,2-6h(3)诱导温度适当摸索,24°C、30°C(4)IPTG浓度可做梯度,1mM(5)超声条件可视实际情况改变,只要使细菌裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠8、测序确认测序引物:pGEX-3通用引物测序样品:过夜菌1ml;质粒(浓度大于50ng/&mu;l,10&mu;l)9、中提质粒(Promega)10、表达纯化GST融合蛋白(1)已经转化的菌液,或者重新转化BL21(DE3)pLysS(2)活化:取20&mu;l菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀释),37°C,250rpm,过夜(16 h)(3)取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀释)(剩余菌液4°C保存)(4)37°C,250 rpm,1 h 10 min-1 h 20 min,OD600 0.6-0.8(OD600小于1.0即可)(5)取1ml菌液作为诱导前对照,冰上放置(6)加入IPTG,终浓度1 mM(7)30°C,250rpm,诱导适当时间(预实验确定)(8)取1ml菌液作为诱导后对照,连同诱导前菌液,12000rpm,离心2min,收集菌体,加入100&mu;l 1×SDS上样缓冲液(9)其余菌液,分为两份,倒入50ml离心管,5000rpm,离心20 min,收集细胞(10)每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体,转移小烧杯中(无气泡)(11)超声破碎细胞:超声3s,间隔10s,40次左右,超声强度200-300W(冰浴)(12)将超声后菌液转移到50ml离心管中,4°C,13000rpm,离心20-30min(13)将上清转移到1个50ml离心管中,取出50&mu;l,加入50&mu;l 2×SDS上样缓冲液(其余上清-80°C保存)(14)将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液(或PBS)重悬,取出50&mu;l,加入50&mu;l 2×SDS上样缓冲液(其余沉淀-80°C保存)(15)将四个样品煮沸3min,12000rpm,离心5min(16)8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适,30&mu;l上样,顺序:诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀(17)考马斯亮蓝染色(18)混匀glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry),取200&mu;l加入15ml离心管中(2份)(19)加入10ml PBS,混匀,3000rpm,离心3min,弃上清(20)加入超声后上清液,4°C轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放)(21)4°C,3000rpm,离心3min(22)10ml GST裂解缓冲液洗涤2次(冰上)(23)10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗涤2次(冰上)(24)弃上清,加入1倍柱床体积的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油),混匀(25)取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE(26)-20°C保存beads11、GST-Pull-down(1)10cm培养皿中,未处理的细胞或者转染的细胞(3-5&mu;g质粒转染10cm培养皿,Cos-7、293T或者其他细胞,转染24h)(2)加入1ml 细胞裂解缓冲液,细胞铲刮下细胞(冰上)(3)将裂解液收集到1.5ml离心管中,振荡30s,冰上放置5min,重复2-3次,充分裂解细胞(4)4°C,12000rpm,离心15min,收集上清(5)测定蛋白浓度,取1mg总蛋白做GST-Pull-down?(6)留30&mu;l作为input对照(input与Pull-down蛋白量约为1/10)(7)其余溶液,加入20&mu;l glutathione sepharose beads(PBS洗涤过),4°C,轻柔振荡20min(8)12000rpm,离心3min(9)收集上清,分为两份,一份加入1-15&mu;g GST结合的beads,另一份加入等量 GST-融合蛋白结合的beads,4°C,轻柔振荡60min(10)3000rpm,离心3min,回收上清(11)1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次(12)弃尽上清,加入25&mu;l 2×SDS上样缓冲液(13)煮沸3min,12000rpm,离心3min(14)SDS-PAGE,上样顺序:细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白(x:LSB)(15)考马斯亮蓝染色或免疫印迹[附录]GST裂解缓冲液(前四个组分配好之后4°C保存,DTT和蛋白酶抑制剂现用现加)配方一500ml贮存液10ml工作液150mM NaCl15 ml 5M NaCl10ml贮存液20mM HEPES pH7.520ml 0.5M Hepes pH7.55mM MgCl210ml 1M MgCl21% TritonX-1005ml 100% Triton-X 1001mM DTT 10&mu;l 1M DTT1mM PMSF 34&mu;l 0.3M PMSFinhibitor cocktail 10&mu;l inhibitor cocktail配方二500ml贮存液10ml工作液200mM NaCl 10ml贮存液25mM HEPES pH7.52mM DTT 20&mu;l 1M DTT1mM PMSF 10&mu;l 1M PMSFinhibitor cocktail 10&mu;l inhibitor cocktailTBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)500ml 贮存液150mM NaCl15ml 5M NaCl20mM Tris pH7.610ml 1M Tris pH7.65mM MgCl2 0.5M MgCl21mM DTT 1M DTT常用IP细胞裂解液500ml贮存液10ml 工作液50mM Tris-HCl, pH7.525ml 1M Tris-HCl, pH7.5150mM NaCl15ml 5M NaCl2mMEDTA2ml 0.5M EDTA0.5% NP4025ml 10% NP400.5% Triton X-10025ml 10% Triton X-1000.5mM DTT2.5ml 1M DTT1mM PMSF 100&mu;l 100mM PMSF1mM NaF1ml 0.5M NaF20&mu;l 0.5M NaFcomplete protease inhibitorscleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 &mu;g immobilized GST or GST-32

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