编译：微科盟萌依依 ，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
背景：程序性死亡1及其配体1（PD-1 / PD-L1）免疫疗法有望用于晚期肺癌治疗，但应答率有待提高。肠道菌群在免疫疗法致敏中起关键作用，人参已显示具有免疫调节潜力。在这项研究中，作者旨在研究人参多糖（GPs）和αPD-1单克隆抗体（mAb）的联合治疗是否可以通过调节肠道菌群来敏化应答。实验方法：作者给同基因小鼠模型施用GPs和αPD-1mAb，通过粪便微生物菌群移植（FMT）和16S PacBio单分子实时（SMRT）测序评估联合治疗对肠道菌群的抗肿瘤敏化作用。为了评估免疫相关的代谢产物，对血浆样品进行了代谢组学分析。结果：作者发现GPs通过增加微生物代谢产物戊酸和降低L-犬尿氨酸以及Kyn / Trp的比例来增加对αPD-1mAb的抗肿瘤反应，这有助于抑制调节性T细胞并在诱导后Teff细胞诱导联合治疗。此外，微生物分析表明，在临床上对PD-1阻滞剂的响应者中，Parabacteroides distasonis和Bacteroides vulgatus的含量高于未响应者。此外，组合疗法通过将肠道菌群从无反应者重塑成有反应者而使从六只无反应者接受FMT的小鼠对PD-1抑制剂的反应敏感。结论作者的结果表明，GPs联合αPD-1mAb可能是使非小细胞肺癌患者对PD-1免疫治疗敏感的一种新策略。肠道菌群可以用作预测抗PD-1免疫疗法反应的新型生物标志物。
原名：Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/ programmed cell death ligand1 (anti-PD- 1/PD-L1) immunotherapy
译名：人参多糖改变肠道菌群和犬尿氨酸/色氨酸比例，增强抗程序性细胞死亡1 /程序性细胞死亡配体1（anti-PD-1 / PD-L1）免疫疗法的抗肿瘤作用
期刊：Gut
IF：23.059
发表时间：2021.5
通讯作者：Elaine Lai-Han Leung & 魏泓 & Yabing Cao
通讯作者单位：澳门科技大学 & 中山大学 & 澳门镜湖医院
1. 联合疗法可增强αPD-1mAb在荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤作用为了研究GP是否可以增强αPD-1mAb的抗肿瘤作用，作者首先评估了接种了LLC（路易斯肺癌细胞）的C57 BL/6J小鼠的肿瘤生长过程。分别在肿瘤接种后第0天和第9天开始对小鼠进行GP灌胃和αPD-1mAb注射（图1A）。最初通过肿瘤体积和肿瘤重量评估其抗肿瘤作用（图1B，C）。联合治疗后，传统的带有LLC的小鼠表现出对αPD-1mAb的增强反应并降低了肿瘤进展（在线补充图1A）。在第24天，与单独的媒介物治疗组和αPD-1mAb治疗组相比，联合治疗组分别表现出75.2％和65.1％的肿瘤生长抑制。相应地，小鼠的存活期显著延长（图1D）。这些结果表明，联合治疗可改善带有LLC的小鼠中αPD-1mAb的抗肿瘤作用。作者还在具有LLC细胞的HuPD-1小鼠（图1E，F）和B16-F10荷瘤的小鼠（在线补充图1B，C）中观察到了这种增强的抗肿瘤作用。
图1 GPs在传统和人源化PD-1敲入（HuPD-1）LLC小鼠中增强了αPD-1mAb的抗肿瘤作用。（A）经GP αPD-1mAb联合治疗LLC小鼠的示意图。（B）每组的肿瘤生长曲线。常规C57 BL/6J小鼠在肿瘤接种后第0天接受GP注射，并在第9天腹膜内注射αPD-1mAb。（C）常规LLC荷瘤小鼠的肿瘤重量。（D）常规LLC小鼠的生存曲线。（E）在携带huPD-1敲入LLC的每组小鼠模型中的肿瘤生长曲线。（F）HuPD-1敲入的荷瘤小鼠的肿瘤重量。数据代表一个或三个独立实验，每组n = 5-10。误差棒代表平均值±SEM。通过具有Sidak校正的双向ANOVA评估肿瘤生长曲线。通过单向方差分析评估肿瘤重量。对生存数据进行对数秩（Mantel-Cox）测试。 * p＜0.05，** p ＜0.01，*** p ＜0.001。 GP，人参多糖； LLC，Lewis肺癌； mAb，单克隆抗体； PD-1，程序性死亡1。为了确定联合疗法对免疫系统的影响，作者使用流式细胞仪分析了外周血，脾脏和肿瘤组织的免疫学变化。作者观察到，与单独的αPD-1mAb组相比，联合组的CD8 / CD4 比在外周（血液和脾脏组织）和肿瘤组织中均增加（图2A）。在外周和肿瘤组织中，CD8 T细胞中功能性细胞因子，IFN-γ，TNF-α和GZMB的产生也均增加（图2B–D，（在线补充图2），表明了该药物组合的有益作用。
图2 组合疗法治疗后，细胞毒性CD8 T细胞数量增加，而Treg细胞数量减少。在带有LLC的小鼠中，接种肿瘤24天后，小鼠用αPD-1mAb，GP或GP和αPD-1mAb联合治疗。分析血液，脾脏和肿瘤中的免疫细胞。（A-E）CD8 / CD4 T细胞比率，血液，脾脏和肿瘤组织中CD8 T细胞和FOXP3 CD4 T细胞中IFN-γ，TNF-α，颗粒酶B（GZMB）的表达。（F）放大400倍时肿瘤组织中CD4，CD8，IFN-γ，TNF-α和GZMB的代表性IHC谱图。比例尺= 50μm。（G–K）使用带有ImmunoRatio插件的image J软件（NIH）对每个视场的正区域进行定量分析。数据表示为15个字段的平均值，并表示为平均值±标准差（n = 6）。将所有实验重复两次或三次。每个符号代表一只动物。数据代表平均值±SD，并通过单向方差分析进行分析。 * p ＜0.05，** p ＜0.01，*** p ＜0.001。GP，人参多糖；IFN-γ，干扰素-γ；IHC，免疫组化；LLC，Lewis肺癌； mAb，单克隆抗体；TNF-α，肿瘤坏死因子-α；Treg，调节性T细胞。作者还观察到外周和肿瘤组织中FoxP3 调节性T（Treg）细胞的下调（图2E），而IHC谱在肿瘤组织中得到了一致的结果（图2F–K），这些结果表明联合治疗可能通过激活CD8 T细胞并抑制Tregs的功能。调节性T细胞（Tregs）是免疫抑制性肿瘤微环境的主要参与者，通常与不良的预后和生存率相关。临床研究已经确定了一组患者，这些患者可能因抗PD-1治疗而导致癌症的HPD（高度进展性疾病）风险增加。在作者的研究中，GP与αPD-1mAb联合使用可减少外周和肿瘤中FoxP3 Treg的比例，这可能有助于预防HPD。总而言之，这些数据表明联合治疗具有增强的抗肿瘤免疫作用。为了研究口服GPs是否会改变肠道菌群，作者对所有治疗组的粪便样本进行了16S PicBio SMRT测序。与单独使用αPD-1mAb的组相比，联合治疗后，微生物组成发生了变化，Muribaculum的丰度显著增加（图3A，B）。当与GP和空白对照组进行比较时，作者还观察到了Muribaculaceae的增加（在线补充图3），这表明GP可能具有丰富Muribaculaceae丰度的潜力。为了进一步阐明肠道菌群与抗肿瘤作用之间的因果关系，作者评估了用抗生素治疗的带有LLC的小鼠的肿瘤生长，发现抗生素治疗损害了抗肿瘤功效（图3C，D）。在维持肠道免疫力方面，对结肠的组织病理学评估表明，联合治疗可减少结肠中炎性细胞的浸润（图3E，F）。IEL在维持屏障功能和降低对感染和免疫病理的敏感性中起着至关重要的作用。为了研究联合治疗是否会影响IEL，作者采用了RNA测序技术来检查小肠中IEL的转录组变化。与单独使用αPD-1mAb的组相比，上皮内保护基因（CLCA3，Zg16，Pla2g10，Agr2，Guca2a和Tff3），28-30个与代谢相关的基因（Dgat2和Ces2a）和S100A6在联合治疗组的表达显著上调。相反，免疫球蛋白可变区重链基因（Ighv1-64，Ighv6-6，Ighv5-4，Ighv1-55，Ighv1-50和Ighv1-26），免疫球蛋白可变区轻链基因（Iglv2），免疫球蛋白κ可变表达在用联合疗法治疗的小鼠的IEL中，基因（Igkv4-68），Lrrk2，Camsap2，Myo5a，Bmf，Slc29a3和Mios被下调（图3G）。基因本体论（GO）分析表明，这些差异表达的基因主要与溶酶体，分泌颗粒和能量代谢有关，可以保护肠屏障的完整性（图3H）。与单纯使用GP组比较时，作者观察到了联合组的免疫应答相关的基因被上调（图3I，J）。
除了 SCFA，我们还测量了 52 种氨基酸和脂肪酸代谢物的变化（在线补充图 4A）。我们观察到，与PD-1 mAb 单独治疗组相比，联合治疗组中 L-犬尿氨酸和 Kyn/Trp 比值（表示为 IDO 活性）显著降低，色氨酸代谢在这些代谢物中的贡献最大，但 L-色氨酸没有（在线补充文件4A–D，图4H-J)。结果表明联合治疗可能与 IDO 活性有关。为了进一步研究肿瘤组织中的 IDO 活性，我们进行了 IHC 染色，发现联合组中 IDO 的表达下调（图4K）。为了确定GPs对肠道微生物中色氨酸代谢的影响，我们通过体外分批发酵系统对GPs进行人粪便样品的元发酵。有趣的是，我们发现在好氧和厌氧发酵条件下，GPs 显著增加 L-色氨酸的产量并降低 L-犬尿氨酸的产量和犬尿氨酸/色氨酸的比例（在线补充表 1），表明 GPs 可以影响通过肠道微生物进行色氨酸代谢。
图5 通过16S PacBio SMRT测序对应答者（Rs）和非应答者（NRs）之间肠道菌群多样性的比较。（A）Rs（n = 10）和NRs （n = 6）组中的Shannon指数。（B）在物种级别上相对于每个组，排名前10位的相对丰度直方图。（C）LEfSe分析用于在使用派姆单抗治疗之前在Rs和NRs之间检测到的差异丰富的分类单元。对于Mann-Whitney检验，阈值参数设置为p = 0.05，对于所有类别，多类分析选择all against all。线性判别分析（LDA）得分> 2.0。（D-G）Rs和NRs之间的差异细菌。数据表示平均值±SD，并通过Mann-Whitney U检验进行分析。5 Pembrolizumab治疗的NSCLC应答者和非应答者中肠道菌群组成存在明显的区别纳入了16名中国NSCLC患者，并接受了抗PD-1阻断剂治疗。其中十名患者被澳门江湖医院的医师评估为有反应者（Rs），六名为无反应者（NRs）。这些患者的临床病理特征列在在线补充表2中。所有患者均接受了30个月以上的随访，并通过CT扫描监测其反应状态（在线补充图5A–C）。为了研究肠道微生物组的组成是否与抗PD-1免疫疗法有关，收集了粪便基线样本，并对其进行了16S PacBio SMRT测序。肠道微生物组的α多样性表明Rs的丰富度和均匀度高于NRs（图5A）。在物种水平上，作者观察到Bacteroides vulgatus的相对丰度在Rs中居首位，并且三种肠道微生物的含量也过高：parabacteroidesdistasonis（p = 0.04），bacterium LF-3（p = 0.02）和Sutterella wadsworthensis HGA0223（p = 0.09；图5B–G，（在线补充文件5D–G）。有趣的是，对于那些具有更好响应和生存率的患者，这些细菌的丰度有所增加。6 GP恢复了非Rs粪便移植的LLC荷瘤小鼠中对αPD-1mAb治疗的反应在作者的初始研究中，作者发现GP增强了LLC荷瘤小鼠中αPD-1mAb的抗肿瘤作用。 GP是否可以逆转人类对αPD-1mAb治疗的反应尚不清楚；因此，作者设计了一个FMT实验来对其进行研究。将来自六个NRs的粪便微生物群转移到GF小鼠中。定居后，将LLC肿瘤细胞接种到小鼠中。然后，使用之前的小鼠操作方案治疗小鼠（图6A）。正如预期的那样，类似于NsR，作者发现小鼠对αPD-1mAb治疗具有抗性。有趣的是，当小鼠用GP加αPD-1mAb进行治疗时，反应得以恢复。联合治疗显著延迟了肿瘤的生长（图6B）。流式细胞仪分析和IHC分析表明，血液和肿瘤中CD8 T细胞的CD8 / CD4 T细胞比例以及IFN-γ，TNF-α和GZMB的产生均增加（图6C–F，H–M ）。作者还观察到联合治疗组中的Treg细胞更少，这与治疗功效的改善相关（图6G）。同时，作者测定了小鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸的含量，发现联合处理后Kyn / Trp比值降低（图6J）。一致地，作者还观察到联合治疗后肿瘤组织中IDO的表达较低（图6K，L）。总体而言，这些数据表明GP可以使LLC小鼠中对αPD-1mAb的反应敏感。
