Immunity|新冠患者TCR、BCR二代测序结果显示与疾病严重程度相关的特征

摘要：

SARS-CoV-2实质上影响了适应性免疫和免疫细胞的结构和功能。对B细胞和SARS-CoV-2抗原表位的反应的聚类有一个初级的研究，B细胞反应显示IGHV3簇驱动的BCR簇与SARS-CoV-2抗体密切相关。SARS-CoV-2特异性T细胞反应是由患者之间共享的TCR簇驱动的，这些簇在疾病过程中具有克隆型特征轨迹和可追溯性。并建立了COVID-19患者的受体序列库以供公众使用。

背景：

没有证据表明COVID-19患者的病毒载量随年龄而变，但是只有一小部分暴露于病毒的个体被感染，而且并非所有感染者都会出现COVID-19症状。SARS-CoV-2感染分为三个阶段：无症状潜伏期（但可能传播给易感个体）；某些患者出现轻度症状期，约19％的确诊病例中，会进展为无症状，以及还有5％的进展为严重症状状态。

结果：

研究选取37位患者的69个时间点，获得了超过620万条BCR数据和830万条以上的 TCR数据。二代测序结果分析主要有患有轻度或中度疾病病程患者、早日康复者以及健康供者。研究假设，可以揭示保护性和有害B和T细胞反应的本质，这可以用来作为患者预后的生物标志物，对于开发SARS-CoV-2的单克隆抗体，以及确定疫苗开发的最佳T细胞参与策略都至关重要。

1.BCR序列IGHV3重排聚类

COVID-19患者中IGH序列多样性略高，丰富程度也更高 ，尤其在康复病例中，更为明显。

图1.HD和正在感染COVID-19的患者以及康复者的外周血IGH指标

与健康供者（HD）相比，在COVID-19患者的储备中，IGH体细胞高频突变只出现了非常轻微的增加。比较在病程中需要机械通气（mechanical ventilation）或体外膜肺氧合（ECMO）的危重患者与不需要任何通气支持（no ventilation）的住院患者的每个患者的体细胞突变BCRs比率。该分析显示，临床病程较重的人携带突变BCR的体细胞高频突变的百分比明显更高，这说明体细胞高频突变(对应于低比例的原始B细胞)是一种更严重的临床表现相关的模式。体细胞高频突变，是一种为了应对从未遇到的抗原，免疫系统产生的一种机制，通过促进免疫球蛋白基因可变区的突变，使免疫细胞受体多样化。

图2.HD和正在感染COVID-19的患者以及康复者的体细胞高频突变率，以及对比严重症与轻症患者的体细胞高频突变率。

作者想通过分析保守序列的特性，来显示COVID-19患者之间B细胞反应的共有特征，从而降低用于识别SARS-CoV-2抗体BCR库的复杂性。在新冠感染者中随机选择13个抗体阳性（就是IgG和IgA），以及6个对照组（COVID-19 IgG和IgA抗体阴性），获得每个样本最常见的50个BCR克隆型，对这19个样本的进行系统发育树分析[图3C 左]。只有其中10个克隆型和4位患者的B细胞簇可以被认为是靶向抗体的潜在来源。为了验证聚类的特异性，选择阳性对照：13个埃博拉病毒免疫疫苗28天后产生抗体的样本和未产生抗体的5个样本进行对比[图3C 右下]，以及阴性对照：13个和6个随机选择的健康供者的BCR[图3C 右上]。系统发育树分析显示，有15个和新冠抗体阳性相关的BCR序列簇，和11个埃博拉相关的簇，以及来自2个健康供者的5个簇。新冠患者中不同个体参与了非常相似的B细胞反应，表现在优先使用了Ig重链可变区3（IGHV3）亚家族基因，且大部分都与IGHJ4（Ig重链连接区4）或IGHJ6基因片段重排。

相比之下，来自埃博拉病毒群的疫苗特异性簇表现出更多分散的IGHV基因使用。值得注意的是，大多数COVID-19特定的IGHV3 BCR簇包含初始的BCR序列（IGHV区突变频率低于一定比例）。和指标数据对比发现对SARS-CoV-2免疫反应更有效的患者的幼稚B细胞池更大。另外，还在8位患者中检测到5种特异性B细胞克隆型，这与另外一篇参考文献[2]中讲到的分离出的抗SARS-CoV-2单域抗体（n3010）非常相似[图3 D]。这些序列也对IGHV3和IGHJ4基因的使用有偏好性，并表现出低水平的体细胞高频突变（与种系V基因具有98％–100％的相似性）。

图3.SARS-CoV-2 ELISA阳性与阴性（左图），HD（右上图）和埃博拉疫苗接种（右下图）的B细胞同类群组系统发育树

2.康复的COVID-19患者在病程中出现共享的T细胞簇

患有COVID-19的患者 TCR 中克隆性指标更高。在恢复时，随着T细胞的大量产生，TCR的多样性和丰富度高于健康供者（HD）水平。这表明实现有效TCR多样化的能力可能决定COVID-19改善预后和免疫控制的机会。

图4.HD和正在感染COVID-19的患者以及康复者的外周血TRB指标

T细胞受体β链可变和连接（TRBV / J）基因使用在COVID-19患者中严重扭曲。

图5.HD和正在感染COVID-19的患者以及康复者的TRBV / TRBJ基因组合使用的PCA图

使用GLIPH2算法（通过互补位热点将淋巴细胞相互作用分组）基于假定的相同抗原识别来聚类TCR序列。另外，计算簇中所有T细胞克隆型的生产频率（pGen， generation probability），具有高pGen的T细胞克隆型为公共克隆型，低pGen集群被认为是私有克隆。因此，如果几个个体之间共享低pGen序列或簇，则可以假定它们是在针对特定触发因素（例如传染性）的定向免疫反应中产生的。在正患有疾病（且大多为严重）中主要为共享克隆型[图6 左图，左下象限和红点]，而仅发现了少数几个低pGen簇被富集[图6 左图，左上象限]，而康复者中存在大量特异性簇（n=2331）[图6 左图，绿点]，包括31个低pGen簇。pGen最低的簇为2-51，序列基序为“ S-GGTGYE”（图6 右图）仅在3例康复患者中共享。

图6.HD和正在感染COVID-19的患者以及康复者的特异性T细胞簇分布和pGen

其中一位患者仅出现轻度疾病，并成功从SARS-CoV-2感染中康复过来。在患病期间（第15、20和23天）康复（第27天）期间对该患者进行采样，这几个时间点上分析该患者的前1000种TCR克隆型，并通过层次聚类分析确定了4种不同的克隆型动态模式[图7 左图]。模式1和2分配了大量的克隆型，呈现相反的轨迹[图7 右图]，从第20天直到恢复，模式2的克隆型频率降低，而模式1的克隆型随时间不断增长，恢复时丰度最高。

图7.在所有时间点上最丰富的1,000个克隆型的归一化克隆型频率的主成分分析（PCA）（左图），和模式1或模式2的克隆型的平均轨迹。

总结与讨论：

对有益的和有害的B细胞和T细胞反应的性质的了解。一方面，有助于具有危险因素的患者更好的预后，并改善对恢复个体中SARS-CoV-2免疫力的监测。另一方面，可用于增强治疗（例如，通过克隆源自康复患者免疫谱的治疗性单克隆抗体），最重要的是，可确定疫苗的最佳T细胞参与策略。

参考文献

[1].Rothe C., Schunk M., Sothmann P., Bretzel G., Froeschl G., Wallrauch C., Zimmer T., Thiel V., Janke C., Guggemos W. Transmission of 2019-nCoV Infection from an Asymptomatic Contact in Germany. N. Engl. J. Med. 2020;382:970–971.

[2].Wu Y., Li C., Xia S., Tian X., Kong Y., Wang Z., Gu C., Zhang R., Tu C., Xie Y. Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2. Cell Host Microbe. 2020;27:891–898.e5.

[3].Schultheiß C, Paschold L, Simnica D, Mohme M, Willscher E, von Wenserski L, Scholz R, Wieters I, Dahlke C, Tolosa E, Sedding DG, Ciesek S, Addo M, Binder M. Next-Generation Sequencing of T and B Cell Receptor Repertoires from COVID-19 Patients Showed Signatures Associated with Severity of Disease. Immunity. 2020 Aug 18;53(2):442-455.e4. doi: 10.1016/j.immuni.2020.06.024. Epub 2020 Jun 30. PMID: 32668194; PMCID: PMC7324317.

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