Acta Neuropathologica：阿尔茨海默病中一种新的Tau剪切亚型

导读：

Tau病，包括阿尔茨海默病(AD)和额颞叶变性(tau病理学)(FTLD-tau)，是一组以Tau过度磷酸化为特征的神经退行性疾病。Tau的翻译后修饰，如磷酸化和截短已被证明是这些Tau蛋白病分子发病机制中的一个重要步骤。

Tau蛋白由17号染色体的MAPT基因表达的，其修饰形式(即磷酸化、聚集或截断)过表达可能引起神经毒性作用。MAPT基因至少有16个外显子，外显子1、4、5、7、9、11、12和13是构成型的，而其他的则是选择性剪接，被被选择性剪接的基因可能产生剪接变体。如阿尔茨海默病的一个关键特征是形成截短的Tau蛋白，促进异常微管组装并诱导聚集，导致功能毒性增加。

近期《Acta Neuropathologica》期刊上发表了题为“A new non-aggregative splicing isoform of human Tau is decreased in Alzheimer's disease”的文章证明了一种新的人类特异性Tau截短形式的存在，它是由人类神经母细胞瘤细胞中内含子12保留产生的，这种保留内含子的RNA会翻译出一个截短的Tau蛋白，类似于AEP切割产生的Tau蛋白，随后额外产生18个氨基酸，大大降低了它的聚集能力。

作者通过比较AD患者与非AD患者新型Tau截短蛋白水平，发现AD患者的这种新型Tau截短水平降低；且这种新Tau亚型不仅有类似的转录后修饰:磷酸化和对微管的亲和力，更比其他Tau亚型更不容易聚集。

最后，作者证明这种新的Tau亚型可能与抑制GSK3β有关，而GSK3β通过调节富丝氨酸/精氨酸剪接因子2 (SRSF2)介导内含子12保留。这种低聚集倾向Tau蛋白的进一步研究可能有助于开发阿尔茨海默病和其他Tau蛋白疾病的治疗方法。

在人类成熟的转录组中存在新的MAPT剪接变体

近来，内含子保留产生新的蛋白异构体在神经退行性疾病如AD、HD中不断被揭露，而天冬酰胺内肽酶(AEP)截短Tau亚型的分裂点与第12外显子的末端重合，由此作者猜想在第12和第13外显子之间寻找可能的内含子保留事件(内含子12)。

经查证，人类12号内含子包含一个典型的终止密码子序列，随后是一个聚腺苷酸化典型位点，所以内含子12包含的基因被翻译成一个截短的蛋白质，类似于AEP (ET-Tau)介导的截断的亚型，含有18个氨基酸，我们称之为W-Tau (图1a)。而这种亚型是人类特有的，因为这种多聚腺苷酸化位点在其他物种(如老鼠)中无法找到。

作者通过使用外显子11匹配的正向寡核苷酸和内含子12反向寡核苷酸的qPCR在成熟SH-SY5Y细胞中，检测到内含子12保留后表达的总RNA和细胞质富集的RNA都是成熟的polyA阳性（即TIR-MAPT），其中内含子11被剪切 (图1a, b)。作者通过使用剪接第12内含子的第12外显子匹配的反向寡核苷酸来检测等效扩增子（图1b），观察到结果与上述类似。此外作者还使用第12外显子正向寡核苷酸和第12内含子反向寡核苷酸得到类似的结果。

奇怪的是，检测第12内含子RNA的且与第10外显子匹配的内含子跨引物从未检测到这些是成熟的胞质polyA阳性RNA（TIR-MAPT）。第10外显子被剪接成Tau3R异构体（3个重复序列），以前有报道称SH-SY5Y细胞主要表达这些Tau异构体。

作为对照，只在人类样本中发现了仅包含外显子的成熟polyA阳性RNA，甚至检测包括第10外显子(Tau 4R)的转录本，尽管效率降低。这些结果也通过相同或不同的寡聚核苷酸通过qPCR被证实（图1c, d）。此外，作者还可以在SY5Y细胞中用特定的引物从起始密码子到内含子12扩增全长的TIR-MAPT cDNA。这个cDNA对应有三个重复和连续的没有插入的TIR-MAPT (TIR-T30)。

在人类样本的海马和额叶皮质中均发现了polyA阳性的TIR-MAPT mRNA(图1e)。但人脑中TIR-MAPT的表达水平是SH-SY5Y的100倍以上，这表明这种RNA在人脑中的相关性比在培养的细胞中更高。此外，作者又使用了来自180名健康供体3个不同脑区363个样本的RNA-seq数据来确认TIR-MAPT转录本的存在。

在大多数样本中，包含12内含子第一部分直到典型终止子位点的TIR-MAPT基因成熟mRNA都得到了表达(图1f)，这支持了之前在人类样本中的发现。比较MAPT成熟mRNA与TIR-MAPT的基因表达情况(图1g)。尽管TIR-MAPT在较低水平上表达，但大量表达这个内含子保留物种的样本表明它在人脑中具有相关功能。

在含有12号内含子的RNA中，有些读者推测对应Tau蛋白是没有插入序列且有3个串联重复序列(T30)，但将12号内含子的序列替换为RNA的3 '端直到第一个终止密码子;称之为TIR-T30。由于内含子12翻译序列中存在两个色氨酸残基(W)，推测该RNA被翻译成蛋白质被命名为W- tau30。这种RNA与SH-SY5Y细胞中发现的RNA相同。

图1 TIR-MAPT RNA表达

W-Tau在人脑中的表达

为了确定这种新的Tau蛋白亚型是否作为蛋白质存在于人脑中，作者获得了针对W-Tau肽独特的18个氨基酸序列的特异性抗体(KKVKGVGWVGCCPWVYGH;W-Tau抗体)，对应于内含子12直到典型终止密码子翻译的蛋白。为了确认该抗体的特异性，作者将TIR-MAPT cDNA（来自SY5Y，TIR-T30对应于W-T30蛋白）克隆到表达载体pSG5 (216201, Agilent technologies)中，并使它在HEK293T细胞中过表达。

最终证明W-T30可以与W-Tau 抗体(Abyntek)或Total Tau抗体 (NOVUSBIO, NB100-82247)特异性免疫沉淀 (图2a)。W-Tau抗体只在对照组未处理的细胞中沉淀W-Tau，而没有任何其他背景 (图2b)。在这两种情况下，免疫沉淀蛋白经Tau 7.51抗体Western blot检测均为Tau蛋白。

为了证实这种特异性，作者将其与其他Tau亚型进行对比，并进一步修改了真核载体pSG5，其含有第10外显子，10外与微管结合域第四串联重复序列和两个Tau插入序列对应(从而得到W-T42)。

此外，天门冬酰胺内肽酶（AEP）截短的Tau相应亚型也克隆到pSG5表达载体(ET:内肽酶截短;ET-T42和ET-T30)；通过在编码天门冬酰胺368的密码子之后包含一个终止密码子来模拟肽内切。作者使用编码W-Tau、ET-Tau和全长等效蛋白(T42和T30)的载体，以及转染了空pSG5载体的对照细胞，在HEK293T细胞上过表达这些蛋白。最终观察到总Tau抗体(如Tau 7.51)能够识别所有这些亚型，但W-Tau抗体只显示W-Tau亚型的信号，而没有其他物种的背景 (图2c)。

该抗体的特异性得到确认后，作者将其用于人类海马和额外侧皮质样本，证实了这种新型Tau亚型蛋白在人脑中的存在 (图2d, e)。在第一张图像中，展示了一个人体受试者的例子，对应于W-Tau的4R形式其主要波段接近52 KDa (图2d, 50 KDa波段)。在38 KDa的一个较小的条带表明在海马样本中存在W-T30亚型。

此外，在31 KDa附近还有另一条被W-Tau抗体识别的条带，这可能被解释为上述条带的裂解产生。作者还通过比较海马和额外侧皮质样本，研究了另三个人的W-Tau表达 (图2e)，观察到52KDa 4R W-Tau条带的表达主要是在额外侧皮质，其表达水平在个体之间存在差异，31KDa条带可能对应W-Tau的截断形式。这些结果表明，内含子12保留Tau亚型在人脑中表达，其中2个内含子在过表达细胞中与W-T42和W-T30的分子量相似。

图2 人脑W-Tau抗体验证及蛋白表达

W-Tau蛋白磷酸化

作者使用编码不同亚型的pSG5载体来诱导这些亚型的过表达，以评估W-Tau蛋白的特性，并将其与全长亚型(T42和T30)和天门冬酰胺内肽酶截断亚型(ET-42和ET30)进行比较(图3a)。首先，研究W-Tau亚型的磷酸化，将其与HEK293T细胞中表达的其他Tau亚型的磷酸化进行了比较。根据已存在的表位和因截短而丢失的表位进行差异检测 (图3a)。发现AT8位点Ser202/Thr205和AT180 (phospho-Thr231)的磷酸化仍发生在截短的亚型中 (图3b, c)。

而PHF1磷酸化位点Ser396/Ser404在截短亚型中没有观察到。另外，一些可修饰的残基处于去磷酸化状态，如Tau 1抗体标签(去磷酸化- Ser195, 198, 199和202) (图3b, c)和phospho-Thr212和phospho-Ser214 (AT100)的阴性染色(数据未显示)。这些结果表明，与其他Tau亚型相比，W-Tau具有类似的翻译后处理过程，至少在上述磷酸化方面是如此。

图3 W-Tau磷酸化模式

W-Tau微管的稳定性和结合能力

作者通过电子显微镜分析了W-Tau蛋白存在和不存在时对小鼠脑微管聚合的影响，结果显示有W-Tau（W-T42）蛋白存在时微管比例更高 (补充图3a)。此外，作者还从表达tau蛋白的细菌中纯化T42、W-T42和ET-T42蛋白并分析与鼠脑中被纯化的微管的结合能力，通过离心分离结合微管和游离Tau蛋白，并通过Tau 5抗体的Western blot分析Tau蛋白对微管蛋白的富集作用 (补充图3b、3c)。

正如预期的那样，所有测试的亚型都能够与微管结合，因为它们都包含微管结合重复序列。值得注意的是，与其他包含4个重复序列和2个插入片段的亚型相比，W-T42对结合微管具有高亲和力。与之前发表的结果一致，ET-T42对微管的亲和力低于全长Tau蛋白。

图S3 W - Tau微管的稳定性和结合能力

 培养细胞中的W - Tau聚集能力

作者比较了在HEK293T细胞中过表达不同Tau蛋白亚型时的聚集趋势，通过定量可溶性和不可溶性Tau蛋白组分(不可溶性组分包括Tau蛋白聚集物) (图4a)。关于全长T42的聚集能力，可以观察到在全长Tau亚型中发现了类似的可溶性/聚集蛋白比率。

然而，在截短的Tau亚型中，W-Tau亚型的比例不同，与全长和ET-Tau亚型相比，W-T30的可溶性蛋白比例显著高于其相应全长T30 (图4b, c)。通过Triton X-100的溶解度测试，进一步证实了这些结果。从W-Tau抗体中获得的信号也可以进行类似的分析。

图4 W-Tau聚合能力

W - Tau蛋白的体外聚集

此外，作者通过体外培养纯化的T42 分析了蛋白聚集物的形成。还对纯化的T42、W-T42和ET-T42与肝素体外孵育后蛋白聚集物的形成进行了分析，观察到与其他亚型相比，W-T42检测时Tau聚集物的比例降低 (图4d)，通过离心上清液(非聚集蛋白)和颗粒(聚集蛋白)中电泳分离蛋白条带的密度测定其比例 (图4e)。这些结果支持W-Tau表现出减弱聚集的倾向。

内含子12保留的潜在机制

ESEFinder 3.0获得的结果表明，在典型的MAPT序列中，靠近第13外显子的开始处存在一个高得分的SRSF6剪接结合位点 (补充图5)。该位点在TIR-MAPT序列中不存在。然而，ESEFinder 3.0表明在内含子12中出现了高得分的SRSF2(也称为SC35)剪接结合位点，而MAPT序列剪接了内含子12。作者使用先前描述的SRSF2结合位点重新分析了MAPT 12-13外显子和12-12-内含子连接序列。

令人惊讶的是发现12外显子 -12内含子连接序列AGGTAAAG与Masaki等人之前描述的SRSF2特异性结合位点AGG TRA G (R for any Purine, a或G)极其相似。这两项分析都表明SRSF2可能在第12内含子和第12内含子的交界处和/或第12内含子的开始处与TIR-MAPT序列结合，表明SRSF2可能参与这一过程的调控。

这一发现进一步被先前明确的证据所支持，即SRSF2也参与了Tau蛋白外显子10的剪接，且该剪接因子对Tau蛋白选择性剪接的调节功能，这可能与本次研究的内含子保留有关。

根据之前的研究成果，发现GSK3介导的SRSF2磷酸化的抑制可以增加外显子10的表达。因此作者通过活化GSK3激酶检测SRSF2磷酸化抑制对MAPT内含子12保留的影响，发现存在GSK3β抑制剂（AR-014418）时，与未处理和Aβ处理的细胞相比，SK-N-MC细胞的TIR-MAPT胞质成熟RNA水平增加 (图5a)。

当分析W-Tau蛋白水平时，可以观察到SB216763和其他GSK3β抑制剂也导致了W-Tau蛋白水平的增加，尽管这种增加与AR-014418更相关 (图5b)。这些初步数据表明SRSF2可能通过GSK3β调控参与这一过程 (图5c)。

最后，值得注意的是，能够刺激GSK3的Aβ的存在并没有导致TIR-MAPT和W-Tau水平的改变 (图5a, b)，这可能是因为GSK3具有组成性活性，因此，淀粉样蛋白处理过的细胞表现为未处理的控制细胞，其中已经含有磷酸化的SC35.然而，如前所述，淀粉样蛋白β确实导致总MAPT RNA的显著增加 (图5)。

图5 GSK3对TIR-MAPT和W-Tau的调控

AD患者脑内TIR - MAPT RNA的表达

作者进一步研究了一组海马脑样本的TIR-MAPT mRNA水平，这些样本来自非痴呆个体和根据Braak分期分类的AD患者。对TIR-MAPT mRNA绝对水平的研究显示，在疾病的第一阶段(Braak II和III)略有减少，但在晚期阶段(Braak V和VI)有所增加，尽管没有发现显著差异 (图6a)。

总MAPT mRNA水平也进行了类似的研究，发现该病例中AD患者相对于健康个体的表达下降，在Braak stage VI中更为显著 (图6b)。这些数据与之前描述的人类RNA序列分析相关。最后研究TIR -MAPT/总MAPT比值时可以观察到Braak VI样本的显著增加以及AD患者相对于非痴呆个体的比例增加的趋势 (图6c)。

图6 AD患者大脑中的TIR-MAPT RNA表达

W - Tau存在于患者大脑中

最后,根据对照组人类的大脑发现 (图2d, e),W-Tau抗体能够从AD患者(Braak第五期和第六期)的提取物中特异性免疫沉淀来自人脑的W-Tau蛋白，该提取物可以用总Tau抗体(Tau 7.51)再次鉴定为Tau (图7a)。上述结果证实后，作者又分析了健康个体和AD Braak不同分期患者的皮层W-Tau蛋白的水平 (图7b)。

观察到W-Tau蛋白在健康和AD个体中均有表达，且对两种人群的W-Tau带的分析显示，与非痴呆个体相比，在AD患者所有Braak阶段，W-Tau蛋白表达均明显减少 (图7c)。

因此，每个W-Tau带的量化也分别在所有Braak阶段和非痴呆个体之间产生显著差异。另一方面，总Tau蛋白的表达似乎在疾病的后期阶段增加，但在人脑样本中，当个体被Braak分期分隔时，无法检测出组间的显著差异 (图7c)。而W-Tau蛋白相对于Tau蛋白总表达的比例显示，在疾病晚期W-Tau蛋白富集(Braak V和VI) (图7c)。

图7 AD患者脑Tau蛋白的测定

此外，作者还对人脑海马样本进行W-Tau蛋白的表达情况的研究 (补充图 6b)。在海马中主要检测到31条KDa (W-Tau截断)和50条KDa (W-T42)带，少量检测到38KDa (W-T30)带。AD患者海马中38 KDa (W-T30)带中W-Tau表达下降的趋势，以及W-Tau/总Tau比值在疾病晚期显著减少 (补充图6c, d)。

图7 患者脑中W-Tau蛋白的测定

这些数据共同表明了W-Tau水平与疾病进展之间的负相关关系，且与总Tau水平的相反，强烈提示了这种新的内含子保留亚型在健康个体中的相关作用，其缺失与疾病的进展相关。AD中W-Tau相对于总Tau量的变化可能更多地与蛋白质转换的差异有关，而不是它们的合成。

总  结

本文证明内含子12保留导致在外显子12后出现含有18个附加残基的Tau亚型。这种新的亚型在AD中明显减少，特别是在晚期，而总的Tau却在累积。且这种新的Tau亚型是人类特有的。内含子12保留的可能机制是反式剪接因子可以被修改，例如通过磷酸化修饰等。

本文描述的新Tau片段与之前报道的AEP裂解产生的片段非常相似。但与AEP裂解产生的片段作用相反，内含子保留截短的亚型表现出潜在的保护行为，其聚集能力降低，但微管组装能力保持。这种新的Tau异构体包含一个独特的18氨基酸的额外肽，W-Tau蛋白聚集能力的降低可能与这一额外肽的存在有关。

此外，W-Tau缺少第4个重复序列后的12个氨基酸，这12个 氨基酸存在于第13外显子中，而这些氨基酸在某些Tau病（包括阿尔茨海默病）患者的脑中的Tau核心蛋白中发现 被认为能够影响蛋白质功能和构象稳定性。

关于这种新的截短亚型与AD发展和进展的相关性，在非痴呆对照组和AD患者样本中发现了类似的TIR-MAPT mRNA水平，然而在蛋白质水平上作者发现健康个体的W-Tau蛋白水平高于AD患者。AD患者中Tau蛋白的RNA和蛋白质水平不一致已经被描述过，在这种情况下，它可能与W-Tau异构体翻译后修饰有关，也可能是其不同序列产生的不同构象有关。

这些数据还显示与总Tau蛋白相比，W-Tau蛋白亚型的聚集模式明显较低，表明这确实是一种不易聚集的Tau蛋白亚型。未来有可能寄希望于对AD中异常剪接的核RNA进行矫正，增加这种低聚集倾向Tau亚型表达，从而发挥治疗AD的作用。

精读原文链接：

Vega García-Escudero, Daniel Ruiz-Gabarre, Ricardo Gargini, Mar Pérez, Esther García, Raquel Cuadros, Ivó H Hernández, Jorge R Cabrera 5, Ramón García-Escudero, José J Lucas, Félix Hernández, Jesús Ávila. A new non-aggregative splicing isoform of human Tau is decreased in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 2021 May 2. doi: 10.1007/s00401-021-02317-z.

完

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编 译 / 章天珍

校 审 / 蔡玉洁

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