PBJ |北京科技大学万向元团队利用CRISPR/Cas9批量化发掘玉米雄性不育转录因子并构建转录调控通路
植物核雄性不育（GMS）突变体及其相应的GMS基因，是解析雄性发育调控机理和开发生物工程雄性不育系统的重要材料。目前，已鉴定植物GMS基因超过100个，主要分为4类：转录因子（TF）、脂代谢、糖代谢和参与其它途径的不育基因（Wanet al., 2019；Wanet al., 2020），其中GMS TF基因在雄性发育过程中发挥重要作用，构成转录调控通路的主线。但与拟南芥和水稻相比，玉米中鉴定的GMS基因数量较少，GMS TF基因则更少，严重制约了玉米雄性发育机制的深度解析和雄性不育分子遗传调控网络的构建。因此，批量化创制玉米GMS TF突变体并解析基因功能机理，对深入理解玉米雄性发育生物学过程尤为重要。
2021年3月27日，北京科技大学、北京中智生物农业国际研究院万向元教授团队在国际著名期刊Plant Biotechnology Journal在线发表题为CRISPR/Cas9-based Discovery of Maize Transcription Factors Regulating Male Sterility and Their Functional Conservation in Plants（Jianget al., 2021）的研究论文。整合利用生物信息学和花药转录组分析以及CRISPR/Cas9技术，建立起一种快速精准创制玉米雄性不育突变体和发掘GMS TF基因的新方法；据此鉴定了12个玉米GMS转录因子新基因；通过GMS TF基因的功能保守性与多样性及其时空特异表达分析等，首次搭建起玉米雄性不育转录调控通路的基本骨架，为深入解析雄性不育分子机理和构建复杂分子遗传调控网络奠定基础。目前已报道的绝大部分GMS基因是通过正向遗传学方法克隆获得，需要依赖GMS突变体，经过基因定位和图位克隆，周期长、效率低（Wanet al., 2019；Wanet al., 2020）。
另一方面，之前克隆的GMS基因通常在花药中特异或高表达。因此，本研究首先对三个不同遗传背景的玉米自交系各自11个发育时期（S5-S12）的花药进行转录组测序（RNA-Seq）和分析，鉴定出1100个三个自交系共有的时期差异表达（Stage-DE）TF基因（图1），既包括6个已克隆的玉米GMS TF基因，也包括在拟南芥、水稻和其他植物中已报道的GMS TF基因的玉米同源基因，表明了该预测方法的可靠性和有效性。
图1. 利用3个遗传背景玉米花药转录组数据分析和鉴定雄性发育相关的转录因子基因
基于上述1100个Stage-DE TF基因，结合其它植物中已报道的核不育基因信息，选取14个玉米雄性发育相关转录因子基因进行CRISPR/Cas9定点突变，最终获得12个玉米GMS TF新基因（ZmTGA9-1/-2/-3、ZmTGA10、ZmbHLH122、ZmbHLH51、ZmMYB84、ZmMYB33-1/-2、ZmPHD11和ZmLBD-10/-27）及其对应的纯合GMS突变体。大部分直系同源TF基因在花药和花粉发育过程中的功能相对保守，但也有部分基因出现功能冗余，如：ZmTGA9-1/-2/-3三基因突变才表现出完全的雄性不育，而双基因或单基因突变均表现雄性可育（图2）。多个同源基因同时发生自然突变的概率极低，因此结合花药转录组分析与CRISPR/Cas9技术，可突破正向遗传学方法在鉴定功能冗余基因研究方面的局限性。此外，ZmbHLH51和ZmbHLH122两个转录因子可形成复合体，共同调控下游靶基因表达；同时开发了检测12个雄性不育转录因子基因突变位点的分子标记，为更多不同遗传背景不育系的创制提供支持。
图2. 基于CRISPR/Cas9技术创制的玉米
ZmTGA9-1/-2/-3三基因突变体表现雄性不育玉米花药发育过程分为14个时期，对应4个发育生物学阶段（Wanet al., 2019）。根据本研究新发现的12个和已报道的6个玉米GMS TF基因的表达模式，结合不同植物中同源基因的功能研究进展，本研究首次搭建起调控玉米花药和花粉发育的转录调控通路 (ZmMs32-ZmMs9-ZmbHLH51/122-ZmMYB84-ZmMs7)，其控制玉米花药绒毡层发育和花粉壁的形成（图3）。
图3. 玉米花药发育14个时期及相关转录调控通路的基本骨架
此外，利用本研究鉴定的玉米GMS TF基因及其突变体申请了7项国家发明专利，分别为：
ZmTGA9-1/-2/-3（ZL202110272886.5）、ZmTGA10（ZL202110272890.1）、ZmbHLH122（ZL202110272020.4）、ZmbHLH51（ZL202110272184.7）、ZmMYB84（ZL202110272146.1）、ZmMYB33-1/-2（ZL202110272228.6）和ZmPHD11（ZL202110272905.4）。
北京科技大学生物与农业研究中心博士生江易林、安学丽教授、李紫文博士、博士生颜廷玮为该论文共同第一作者，万向元教授为通讯作者。该研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、中央高校基本科研业务费和北京市科技计划项目等联合资助。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13590
参考文献：
Jiang Y, An X, Li Z, Yan T, Zhu T, Xie K, Liu S, Hou Q, Zhao L, Wu S, Liu X, Zhang S, He W, Li F, Li J, Wan X. 2021. CRISPR/Cas9-based Discovery of Maize Transcription Factors Regulating Male Sterility and Their Functional Conservation in Plants.Plant Biotechnology Journal19,doi.org/10.1111/pbi.13590
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Wan X, Wu S, Li Z, Dong Z, An X, Ma B, Tian Y, Li J. 2019. Maize Genic Male-Sterility Genes and Their Applications in Hybrid Breeding: Progress and Perspectives.Molecular Plant
12, 321-342
Wan X, Wu S, Li Z, An X, Tian Y. 2020. Lipid metabolism: critical roles in male fertility and other aspects of reproductive development in plants.Molecular Plant13, 955-983.
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