酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤

酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、标准孔、待测样品孔。 在酶标包被板上标准品准确加样50µl， 待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值） 。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/ mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。浓度标准品号配法160ng / L 5号标准品150µl的原倍标准品加入150µl标准品稀释液80ng / L 4号标准品150µl的5 号标准品加入150µl标准品稀释液40ng / L3号标准品150µl的4号标准品加入150µl标准品稀释液20ng / L2号标准品150µl的3 号标准品加入150µl标准品稀释液10ng / L1号标准品150µl的2号标准品加入150µl标准品稀释液< 表 1  >常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。出现这种现象的可能原因：1.试剂盒超过有效期或者保存温度不当；2.不同试剂盒的组分混用或替代；3.洗板或者加样过程中，酶标记物受到污染导致活力和效价降低；4.实验操作中试剂的加样顺序有误；5.蒸馏水水质不好、混有其他化学物质或配制的洗涤液pH值偏高/低。二、显色弱、灵敏度低现象一：显色结束后，所有板孔的颜色均较淡，只有微弱的信号呈现。出现这种现象的可能原因：1.试剂盒超过有效期或者保存温度不当；2.试剂、样本在使用前没有平衡至室温；3.标准品/浓缩液试剂配置前未离心；4.工作液稀释比例不当；5.工作液提前配制的时间较久；6.移液器计量不准，加入试剂的体积有误；7.洗板或者加样过程中，酶标记物受到污染导致活力和效价降低；8.温育时间/温度未达到实验要求；9.浓缩洗涤液的稀释倍数/洗板次数不符合实验要求；洗涤冲击力太大，浸泡时间太久；10.双组份显色剂加入顺序颠倒且未混匀；11.底物作用时间较短，显色不足。现象二：显色结束后，标准孔显色正常，但标本孔显色较弱。出现这种现象的可能原因：1.标本处理不当，比如加入叠氮钠作为防腐剂，影响显色；组织匀浆或细胞提取液中引入SDS等化学物质后影响抗原结构等；2.样本浓度较低(样本实际浓度低/样本保存不当有降解/样本稀释倍数过大)；3.样本浓度很高，稀释倍数不够，出现钩状效应(当抗原与抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗原过量又称为后带效应)；4.样本类型特殊，比如样本pH值较高/低，抗体结合抗原能力降低；样本为重组蛋白，抗体和抗原的结构不匹配等；现象三：终止后，目测结果正常，但酶标仪读值结果偏低。出现这种现象的可能原因：1.酶标仪未预热；酶标仪参数设定不正确；滤光片不匹配；2.终止后间隔酶标仪读数的时间过久(超过20 min)。三、灵敏度过高、板孔高、背景高现象一：终止后，整板显现较为均一的黄色或淡黄色，差异不明显；标准品背景孔OD值过高(超过0.15)。出现这种现象的可能原因：1.不同试剂盒的组分混用或替代；2.稀释后的工作液浓度较高，可能是稀释前未离心或者取液量不准确；3.温育温度过高或温育时间过长；4.显色剂保存不当，未避光；双组份显色剂提前配制的时间较久；显色时间过长(超过30 min)；5.洗涤不当，洗涤时每孔注入的洗液不够或洗涤次数不够；现象二：出现随机性的花板、跳孔现象。出现这种现象的可能原因：1.样本的收集、处理和保存方法不当导致个体差异大；2.样本质量较差，个别有溶血、高脂、粘度大等现象；3.样本浓度过高，钩状效应导致样本测值差异大；4.试剂盒保存不当，酶标板封闭效果降低；5.加样问题，未更换枪头、枪头误差大或枪头触碰孔底孔壁而划伤包被原；上样产生气泡或者加到孔壁；加样时间过长，各孔初始孵育温度不一致；6.试剂稀释不均匀；7.恒温箱孵育时板孔未贴覆膜或将覆膜反复使用；8.洗板不完全，出现交叉污染或者有残留；9.试剂污染，主要是洗涤液污染或未现配现用；10.酶标仪读值前板底残留有液滴或指印。四、假阳性现象：实验结束后，标曲正常，样本测值整体比预期浓度高且差异不显著。出现这种现象的可能原因：1.样本处理不当，含非特异性显色或干扰显色的内源性成分(脂质、胆红素、血红蛋白或血液粘度过大等)；组织匀浆或细胞提取液中引入其他溶剂导致基质效应过高等；2.样本污染，含非特异性显色或干扰显色的外源性成分；3.试剂盒保存不当，体系变化导致部分样本类型的回收率发生变化；4.加样过程中未更换枪头。五、重复性差(批内/批间差异大)现象一：批内变异系数大(类似花板、跳孔现象)。出现这种现象的可能原因：1.试剂盒保存不当；2.样本或试剂稀释不均匀；3.加样问题，未更换枪头、枪头误差大或枪头触碰孔底孔壁而划伤包被原；上样产生气泡或者加到孔壁；加样时间过长，各孔初始孵育温度不一致；4.洗板不完全，出现交叉污染或者有残留；5.使用水浴锅温育；6.酶标仪未预热，样本读值前未震荡混匀；7.样本浓度低，在阈值附近时阴时阳。现象二：批间变异系数大。出现这种现象的可能原因：1.样本本身质量或者浓度有差异；2.试剂盒保存不当，试剂有降解；3.样本稀释倍数存在差异；4.实验条件、操作人员或操作手法存在差异；5.酶标仪测定重复性差；酶标仪滤光片不对或输入波长不对。