在肿瘤治疗领域，为何外泌体成为半路杀出的黑马？
图片来自asunow.asu.edu
外泌体作为介入肿瘤生长及转移一系列过程的“忠臣”，成为癌症治疗重要“靶子”不足为怪。事实上，外泌体还是液体活检的一匹黑马，在药物传递的舞台上也占据一席之地。被忽略了几十年后外泌体总算扬眉吐气，在过去短短几年里就赚足了眼球，也受到了资本的大力追捧。这一派欣欣向荣的景象背后是否又暗藏危机？
撰文 | 丁 零
责编 | 叶水送
癌症靶向疗法的新宠
抑制外泌体可借鉴预防蚊虫叮咬的策略：第一招，直接杀死蚊虫，即破坏外泌体的合成和分泌；第二招：所谓不敌其力，而消其势。换而言之，就是留蚊虫一条生路，却让它的叮咬无害。若不能把外泌体扼杀在摇篮，就抑制它的进攻能力；第三招：涂上六神花露水，让蚊虫无法靠近。想象一下，释放出的外泌体无处可去，那就是没有任何威胁力的流浪汉，而不是凶悍的霸凌【1】。
图一：外泌体靶向治疗策略，图片来源：Trends Pharmacol Sci, 2016. 37（7）: p. 606-17
A.破坏外泌体合成和分泌
庆幸的是，这几位工程师都有能克制它们的对手。类肝素酶的死对头，PG545和M402，在动物模型中成功显示出抗肿瘤转移活性【5】。
当然，除对付外泌体外，类肝素酶还有其他和癌症有关的功能。而液泡ATP的抑制剂也已被证明可干扰外泌体释放，并具有改善耐药性的双重作用【6】。
B.调包外泌体
姜黄素，顾名思义和姜有关，这是从姜科植物的根茎中提取的一种化学成分，是居家必用的好调料，也是几千年来中国和印度的传统草药成分。著名的医药公司强生还生产过姜黄素创可贴，用来促进伤口愈合。
那这黄黄的、辣辣的东西和癌症有什么关系呢？因其有抗氧化和抗炎症作用，大量的研究证明姜黄素对肿瘤发展的抑制作用。最近的研究表明，姜黄素还可以“狸猫换太子”，把癌细胞外泌体投递的、帮助癌症生长的危险包裹给换掉【7】。
C.阻断外泌体签收
试图阻断外泌体签收。要么在外泌体运输的途中把它干掉，要么就是阻止它进入受体细胞。怎么在运输途中半路截胡外泌体呢？一种方法是安插人造的外泌体，正牌外泌体以为遇到了同伴，趁着它放松警惕的时候捣乱。比如说，如果正牌外泌体携带微RNA，就可以在人造外泌体里加入和这种微RNA互补的寡核苷酸，紧紧抱住危险微RNA不让它去使坏。
当外泌体进入受体细胞时，会和受体细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）受体结合。显而易见，如用药物把HSPG受体的结合位点给占据，那外泌体就无从下手。而肝素便是这可以和外泌体抢占山头（HSPG）的有力竞争者。
肿瘤液体活检，最大特点就是不动刀、只见血，也就是说不需要从病人体内刮组织，只需要取血。当下最流行的四种液体活检生物标记物分别是循环肿瘤细胞（CTC），循环肿瘤DNA（ctDNA）/无细胞DNA（cfRNA）、循环RNA，以及这些年常上头条的肿瘤外泌体。获取样品后通过高通量测序技术解密各种信息，以此侦查肿瘤行踪和动态来帮助诊断和对症下药。
2017年，《世界经济论坛》全球十大新兴技术榜单液体活检荣膺榜首【8】。外泌体想从这四大液体活检家族脱颖而出可不简单。
先说说老大哥循环肿瘤细胞，是这几位里唯一拥有心肝脾肺肾的完整个体，其信息量显然最全面。但哪怕是晚期癌症患者，每毫升血仅有1-10个循环肿瘤细胞【9】。病人身体本来虚弱，靠大量取血获得足够样本显然不现实。再者，想象一下要从上亿个白细胞、红细胞里找这屈指可数的循环肿瘤细胞，简直就是大海捞针。
那DNA和RNA呢？姑且不追究同一病人运动前后血液里DNA / RNA都有差异的事实，也暂且设定未来技术可有效分离肿瘤以及正常细胞的DNA / RNA（正常细胞DNA / RNA约占血液总DNA / RNA的95%），能从这两兄弟得到的信息只是冰山一角。毕竟从DNA / RNA 到蛋白表达，功能，再到和微环境的相互制约，是一个复杂的多因素调控过程。
图二：液体活检在癌症治疗和诊断的贡献，图片来源：Transl Lung Cancer Res, 2016. 5（5）: p. 466-482.
外泌体是不是就是当之无愧的液体活检神器？暂且卖个关子。先聊聊致力于外泌体肿瘤诊断的代表企业。
最具代表性的便是成立于2008年的Exosome Diagnostics，一个着实多金又多朋友的主。短短十年，Exosome Diagnostics已完成了一个亿的小目标，并且广交朋友，包括医药界的巨头武田、默克、安进以及全球科研工作者都熟悉的供应商凯杰（QIAGEN），还在2017年八月加入了医疗保险界朋友圈，和保险商CareFirst加为盟友，以此推进其头牌产品EvoDx的商业化。
2016年1月，Exosome Diagnostics推出了世界首款从血液样本分离和分析外泌体RNA的液体活检产品，可灵敏、准确、实时检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EML4-ALK突变，而针对前列腺癌的，则是采取尿液样本来收集外泌体。
2020年新冠疫情期间，Exosome Diagnostics推出了“家用版”前列腺测试，可见其雄心勃勃要保持江湖霸主的地位，难怪2018年，Bio-Techne 给Exosome Diagnostics投来了2.5亿美元的橄榄枝，将其纳入麾下。
这家靠着外泌体发家的公司，并没有排斥同行，而是抱着合作的态度。2017年年底发表了一篇关于非小细胞肺癌（NSCLC）患者中EGFR液体活检检测的研究。该研究表明，与检测ctDNA比，同步检测cfDNA和外泌体RNA可将灵敏度提高10%左右【10】。可惜的是文章并没有展示外泌体RNA单独的检测灵敏度.
图三：EXO1000平台分析外泌体RNA+cfDNA（exoNA）和ctDNA分析比较，图片来源：Ann Oncol. 2018 Mar; 29（3）: 700–706
由此可见，尽管外泌体有它的优势，但合作才是硬道理。现在再回到之前提到的疑问，外泌体就一点缺点都没有吗？显然不是。
和循环肿瘤细胞比较，外泌体数目上有绝对的优势，但它的提取纯度和数量依旧不尽如人意。再者，外泌体来源胞浆，所以DNA含量相对来说很少，这也是为何Exosome Diagnostics会选择同时检测cfDNA和外泌体。再者，外泌体是来源于一系列基因多样的肿瘤细胞，如何在多异化中寻找信息也是一大挑战。
在一家独大的情况下，可想而知若没有独门武器，很难抢占一席之地。在这种形势下，另一家公司，Peregrine Pharmaceuticals（2018年改名为Avid Bioservices）与Exosome Diagnostics以核酸作为切入点的战略不一样，而是通过测量血浆中含有磷脂酰丝氨酸（PS）的外泌体水平来区分健康者和卵巢肿瘤患者，以全新的概念在外泌体诊断市场上分一杯羹。
概念认证实验中分析了34名卵巢肿瘤患者和10名健康受试者血浆外泌体表达PS的水平，结果显示，卵巢癌患者的外泌体磷脂酰丝氨酸（PS）水平明显高于健康受试者【11】。
上文我们聊到以外泌体为靶向作为癌症治疗的策略，如果单纯是这样，那就一点都不新鲜了。开个脑洞，癌细胞可以释放外泌体作为武器，可别忘了癌细胞也可以吸收外泌体。这就给了人类机会设计外泌体给癌细胞下毒，于是就有了这两个享誉江湖的“黄药师”。
第一个叫Codiak BioSciences，成立于2015年，最开始也是外泌体诊断起家，利用外泌体中的KRAS突变基因来诊断胰腺癌。借助日益成熟基因工程，Codiak创始人Raghu Kalluri 充分利用了中国古典智慧：以其人之道还治其人之身。通过体外改造将特异靶向KRAS突变基因的RNAi（RNA干扰）偷偷安插到外泌体内，直接把KRAS突变基因给敲掉。
提到这，懂行情的人就有疑问了。虽然KRAS属于“不可成药” 靶点，但这几年AMG510和MRTX849等小分子药物都有不错的临床数据。再者传递RNAi可以别的载体呀，比如脂质体等纳米颗粒。妙就妙在这里，外泌体是纯自然的，可防止被免疫系统排斥。
图四：携带siRNA外泌体靶向KRAS基因突变的示意图，图片来源：Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017. 14（11）: p. 636-638
另一家利用外泌体治疗癌症的公司Exovita Biosciences也成立于2015年，它的治疗理念更为奇特。某年某月的某一天，新墨西哥大学Kristina Trujillo 教授出于好奇，用癌组织附近5厘米处组织分泌的外泌体处理癌细胞。第二天醒来，意外发现癌细胞全死翘翘了。Trujillo难以置信，可接下来在不同病人身上取的组织都有同样的效果，并且这些外泌体对正常细胞并没有任何副作用。
Exovita Biosciences 成立以来火势很猛，同年便拿了170万科研基金。可自此之后没有任何动静，这不得不让人担忧，会不会又是一场龙头蛇尾的演绎。毕竟，这个故事 too good to be true （精彩得让人难以置信）。
除了利用外泌体治疗癌症，另一条思路是把外泌体当作药物的传递工具。被谷歌基金看好的Evox Therapeutics 是此领域比较成熟的公司，主要针对神经相关的疾病，2020年6月和礼来签署了 12 亿美元的合作协议，开发 RNA干扰和反义寡核苷酸药物递送外泌体载体。
作为纯天然的载体，上文提到外泌体可逃避人体免疫细胞的追击，除此之外，外泌体还有潜力解决神经类药物的一个老大难问题，就是穿越血脑屏障【15，16】，并且能在极端条件（比如酸，消化酶等）下生存，给实现口服提供了可能性。
图五：外泌体穿越血脑屏障示意图，图片来源：Cell Mol Bioeng. 2016 Dec;9（4）:509-529
《礼记・大学》云：是君子无所不用其极。在和癌症斗争的历史里，人类做过无数次的尝试，从小分子，到大分子核酸、蛋白，再到细胞治疗，而外泌体作为介于分子和细胞之间的微小结构，是不是一颗崭露头角的遗珠呢？
图六：外泌体在癌症中的应用，图片来源：Int J Mol Sci. 2020 Jul 28;21（15）:E5373
现阶段还有很多技术问题必须解决，其中外泌体药物生产工业化（规模、纯度、成本、一致性和标准化）是目前面临的重大挑战。只有从根本上破解外泌体在肿瘤发展中的真实作用，后期临床才不是空中阁楼。任重道远。
丁零，生物化学博士，青年写作者。曾就职霍华德·休斯医学研究所及MD安德森癌症中心，现从事咨询行业。
参考资料
1. Syn, N., et al., Exosome-Mediated Metastasis: From Epithelial-Mesenchymal Transition to Escape from Immunosurveillance. Trends Pharmacol Sci, 2016. 37（7）: p. 606-17.
2.Thompson, C.A., et al., Heparanase regulates secretion, composition, and function of tumor cell-derived exosomes. J Biol Chem, 2013. 288（14）: p. 10093-9.
3.Liegeois, S., et al., The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. J Cell Biol, 2006. 173（6）: p. 949-61.
5. Ramani, V.C., et al., The heparanase/syndecan-1 axis in cancer: mechanisms and therapies. FEBS J, 2013. 280（10）: p. 2294-306.
6.Federici, C., et al., Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin. PLoS One, 2014. 9（2）: p. e88193.
7. Taverna, S., et al., Curcumin inhibits in vitro and in vivo chronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21. Oncotarget, 2015. 6（26）: p. 21918-33.
8.Cann, O., These are the top 10 emerging technologies of 2017. World Economic Forum, 2017.
9.Miller, M.C., G.V. Doyle, and L.W. Terstappen, Significance of Circulating Tumor Cells Detected by the CellSearch System in Patients with Metastatic Breast Colorectal and Prostate Cancer. J Oncol, 2010. 2010: p. 617421.
10.Krug, A.K., et al., Improved EGFR mutation detection using combined exosomal RNA and circulating tumor DNA in NSCLC patient plasma. Ann Oncol, 2017.
11.Lea, J., et al., Detection of phosphatidylserine-positive exosomes as a diagnostic marker for ovarian malignancies: a proof of concept study. Oncotarget, 2017. 8（9）: p. 14395-14407.
12.Kamerkar, S., et al., Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer. Nature, 2017. 546（7659）: p. 498-503.
13.Buscail, L., Pancreatic cancer: Exosomes for targeting KRAS in the treatment of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017. 14（11）: p. 636-638.
14.Melo, S.A., et al., Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature, 2015. 523（7559）: p. 177-82.
15.Saeedi, S., et al., The emerging role of exosomes in mental disorders. Transl Psychiatry, 2019. 9（1）: p. 122.
16.Chen, C.C., et al., Elucidation of Exosome Migration across the Blood-Brain Barrier Model In Vitro. Cell Mol Bioeng, 2016. 9（4）: p. 509-529.