同时靶向TGF-β/PD-L1与放疗协同作用通过重新编程肿瘤微环境克服免疫逃避
❀ 研究背景 ❀
· 转化生长因子β（TGFβ）
Ø 转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的 TGF-β 超家族。这一家族除 TGF-β 外，还有活化素（activins)、抑制素（inhibins)、缪勒氏管抑制质（Muller ianinhibitor substance, MIS)和骨形成蛋白（bonemorpho-genetic proteins,BMPs）等。
Ø TGF-β 的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化，即在表皮生长因子（EGF）同时存在的条件下，改变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度依赖的抑制作用。TGF-β与早先报道的从非洲绿猴肾上皮细胞 BSC-1 所分泌的生长抑制因子是同一物。
Ø 机体多种细胞均可分泌非活性状态的 TGF-β。在体外，非活性状态的 TGF-β 又称为Latency associated peptide（LAP），通过酸处理可被活化。在体内，骨折或正在愈合的伤口，蛋白本身的裂解作用可使 TGF-β复合体变为活化 TGF-β。一般在细胞分化活跃的组织常含有较高水平的 TGF-β，如成骨细胞、肾脏、骨髓和胎肝的造血细胞。TGF-β1 在人血小板和哺乳动物骨中含量最高；TGF-β2 在猪血小板和哺乳动物骨中含量最高；TGF-β3 以间充质起源的细胞产生为主。
Ø 活化后T细胞或B细胞产生 TGF-β 水平比静止细胞明显为高。几乎所有肿瘤细胞内可检测到 TGF-β mRNA。神经胶质细胞瘤在体内可分泌较高水平的 TGF-β。
Ø TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。TGF-β1、β2和β3功能相似，一般来说，TGF-β 对间充质起源的细胞起刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用：功能如下：抑制免疫活性细胞的增殖；抑制 IL-2 诱导的T细胞IL-2R、TfR和TLiSA1活化抗原的表达；抑制 IFN-γ 诱导黑素瘤细胞 MHC-Ⅱ类抗原表达；抑制淋巴细胞的分化以及抑制细胞因子产生；促进成纤维细胞、成骨细胞和施旺氏细胞生长；TGF-β1、TGF-β2 促进人成纤维细胞 IL-6 的产生，其机理可能是通过对 IL-6 基因转录的调节；抑制上皮细胞、破骨细胞、内皮细胞生长和脂肪、心肌、骨骼肌的形成；促进细胞外基质（ECM）如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制 ECM 的降解；TGF-β1 能诱导 c-sis 的表达，但抑制 c-MYC 的表达，这种诱导或抑制作用与作用细胞种类及 TGF-β 的不同功能有关。
· PD-L1/TGF-β双功能融合蛋白M7824即bintrafusp alfa (BA)
Ø M7824 是一种双功能融合蛋白，一端是能够识别结合 PD-L1 的抗体结构（Y），另一端是可以结合 TGF-β 的 TGF-β 受体II型融合蛋白（Trap），能够同时阻断 PD-L1 和 TGF-β 这两条信号通路，解除免疫系统的抑制状态，提高免疫系统对癌症细胞的杀伤作用。
Ø INTR@PIDLung037 研究是一项多中心、随机、开放、对照研究，旨在评估 M7824 vs 帕博利珠单抗一线治疗 PD-L1 高表达晚期 NSCLC 的疗效。共招募了584例受试者，分别接受每2周静注M78241 200mg或每3周静注帕博利珠单抗 200mg 治疗，直至疾病进展。主要终点为独立评审委员会(IRC)评估的无进展生存期和总生存期。
Ø 2021年默克公布了其潜在 first-in-class 靶向 PD-L1/TGF-β 的双功能融合蛋白类肿瘤免疫疗法 M7824（bintrafuspalfa）III期 INTR@PID Lung 037研究和扩展性 INTR@PID 研究最新进展。
Ø 在回顾了正在进行的 M7824 一线治疗 PD-L1 高表达 IV 期 NSCLC 患者临床研究INTR@PIDLung 037（NCT03631706）总体数据后，独立数据监测委员会于2021年1月19日建议停止该项临床试验。基于这一建议，德国默克决定终止该项研究，因为该研究不太可能达到共同主要终点，特别是无进展生存期。
· M7824在研临床试验
❀ 研究假设 ❀
Ø 在 BART 联合治疗中，通过 BA 同时阻断 TGF-β 和 PD-L1 通路可以协同 RT 消除免疫性冷肿瘤，而 TGF-β 阻断可以减少联合 ICIs 和 RT 的毒性。
❀ 技术路线 ❀
❀ 研究结果 ❀
1、BART增强免疫浸润不良的多种小鼠肿瘤模型的抗肿瘤活性
Ø 我们在几种缺乏TIL 的小鼠肿瘤模型中评估了 BART 的抗肿瘤活性。为了检测肿瘤负荷和代谢活动，使用了18 F-氟脱氧葡萄糖 (FDG) 的正电子发射断层扫描(PET).
Ø 在 KPC 肿瘤中（A-D），与抗 PD-L1/TGF-β 对照相比，治疗开始后第 8 天，BA单药治疗显着降低了18F-FDG 最大标准化摄取值（SUV max) 。BART与 BA 或 RT 单一疗法相比，以及相对于 RT TGF-β 陷阱或 RT 抗 PD-L1 的组合，进一步降低了18 F-FDG SUV max(CD)。
Ø LLC 肿瘤通常缺乏 TIL，并且对抗 PD-L1 治疗无反应。在该模型中，相对于第 11 天的同种型对照，BA (42.6%) 和 RT (52.8%) 单一疗法均诱导了显着的肿瘤生长抑制 (TGI)（图1E）。BART 相对于 BA 或 RT 进一步增强了 TGI (84.5%)，并且相对于 BA（14 天，p < 0.0001）或 RT（18 天，p < 0.0001）显着延长了生存期（中位生存期，26.5 天）。
Ø 在治疗开始后的第 16 天，与 TGF-β 陷阱或抗 PD-L1 相比，BA 单一疗法显示出显着延迟的肿瘤生长，与 BA 或 RT 单一疗法相比，BART 进一步延迟了肿瘤生长或RT TGF-β 或抗 PD-L1 (p = 0.0035) 的组合。
Ø 在 LLC/GBM/4T1 模型中，BART 相对于 BA 或 RT 进一步增强了 肿瘤生长抑制(TGI) ，并且相对于 BA或 RT显着延长了生存期。
2、BART 减弱组织纤维化并增加肿瘤浸润白细胞
Ø 在 4T1 模型中，与同种型对照相比，BA 显着降低了基质 α-SMA 的表达。尽管 RT 显着增加了 α-SMA 水平，与 RT 激活 CAF 一致，但 BA 能够逆转 RT 诱导的 α-SMA（图2A 和 2B ）。
Ø 放疗单一疗法增加了肿瘤胶原沉积。BA 与 RT 相比逆转了 RT 诱导的胶原沉积，这可能是 CAF 活性降低的结果（图2C和 2D）。
Ø 相对于同种型对照治疗的 4T1 肿瘤的瘤内 MVD，BA 的 MVD 略微降低，并在 RT 后逐渐进一步降低（图 2E 和 2F）。
Ø 使用免疫组织化学(IHC) 和荧光激活细胞分选 (FACS) 分析在 4T1 肌内 (im) 模型中进一步研究了免疫反应。与 BA 或 RT 单一疗法相比，BART 显着增加了瘤内 CD8 细胞的密度（图2G 和 2H）。
Ø 在放疗后第 3 天，BART 与单药治疗相比显着增加了肿瘤相关树突状细胞 (DC) 的密度（图 2I）.
Ø 与这些发现一致，在放疗后第 7 天，与任一单一疗法相比，BART 显着增加了增殖 CD8 TIL 的密度（图2J）。
Ø 在功能上，BART 对原发肿瘤生长和延长存活的抑制作用被拮抗 CD8 T 细胞部分抵消（图2K 和 2L）。
3、BART 诱导与单一疗法不同的肿瘤基因表达特征
Ø BA 和 BART 分别相对于同型对照和 RT 显着降低了 TGF-β 特征的评分（图3A）。我们接下来研究了 TME 重塑和免疫激活面板中特征的表达。在 TME 重塑面板中，BA 显着降低了RT诱导的纤维化(RIF)、ECM、上皮间质转化(EMT)、血管内皮生长因子(VEGF)通路和缺氧元特征的预测特征评分，而 RT 趋向于增加这些分数，并且与同型对照相比，EMT和缺氧特征显着增加。BART 相对于 RT 显着降低了所有这些特征（图 3B-3F）。在免疫激活面板中，尽管 BA 显着增加了干扰素基因 (STING) 的刺激物，并略微增加了干扰素 (IFN) 相关的特征评分，但 RT 强烈上调了两种特征的表达。BART 与同种型对照和 BA 相比显着增加了 STING 和 IFN 特征，但与 RT 相比没有显着增加（图3G 和 3H）。
Ø 在该模型中，RT 显着增加了肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 特征，而 BA 略微降低了该特征，而 BART 部分增加了 TAM 特征评分（图 3I），表明 BA 和 RT 对 TAM 的影响相反基因表达。与任一单一疗法相比，BART 还显着增加了 NK 细胞特征（图3J），尽管两种单一疗法都没有任何效果，这表明 BA 和 RT 在调节 NK 细胞方面可能存在协同效应。BA 降低了 MDSC 基因特征与同种型对照（图 3K)。尽管 RT 对 MDSC 特征评分没有显着影响，但与任一单一疗法相比，BART 进一步降低了该特征，表明两种治疗之间存在潜在的累加效应。
4、BART 相关基因表达特征在临床数据中具有预后意义
Ø 为了评估在 4T1 模型中鉴定的 BART 调节基因的预后意义，我们分析了来自 IMvigor210 单臂 II 期试验的患者数据，该试验研究了抗 PD-L1 阿特珠单抗在转移性尿路上皮癌患者中的有效性和安全性，基于 BART 与 RT DEG 在 4T1 模型（图 S4A，表 S4）中确定的相关矩阵的分层聚类确定了三个患者亚组，在 BART DEG 衍生的三个亚组中，与第1组和第2组患者相比，第 3 组患者的生存率显着提高，（第1组和第2组的中位生存期分别为 7.7 和 8.3 个月；聚类3中位生存期为未定义， log rank p=0.0022）,表明其为更好的预后分层（图3L）。
Ø 进一步描绘 BART 相关基因的潜在分子变化显示，与第2组或第1组患者相比，第3组中对ICI治疗表现出良好预后的患者 TGF-b 信号相关基因(CTGF、MMP13、NCAM1和TGFB2)表达减少，免疫激活相关基因(GZMA、IL2RA 和 NKG7 )的表达增强(图3M)。
5、BART 增强对自发性 4T1 肺转移性疾病的远隔效应
Ø 使用表达荧光素酶的 4T1 细胞和生物发光成像 (BLI) 来测试 BART 是否增强抗肿瘤免疫并改善已建立的不直接被 RT 靶向的自发性肺转移（图4A）。通过离体 BLI 在接种肿瘤后 10 天（第-1天），在荷瘤小鼠的肺中证实了继发性疾病的建立，而在健康肺中未检测到发光（图4B 和 4C）。第二天（第 0 天），小鼠全身接受 BA 治疗，并通过小动物放射研究平台（SARRP）单独接受原发肿瘤放疗（图 4A 和 4D)。
Ø BA 和 RT 单一疗法均在第 22 天诱导了原发性原位肿瘤的显着 TGI（分别为 27.0% 和 64.9%），与 BA 或 RT 相比，BART 进一步增强了 TGI（82.8%）（图 4E），表明潜在的累加效应控制原发肿瘤的生长。相对于同种型对照，BA 在第 13 天显着降低肺 BLI，但在 RT 治疗后的第 20 天没有显着降低，而 RT 在任何一天都没有影响。然而，与同种型对照或 RT 或BA单一疗法相比，BART 在第 13 天和第 20 天显着降低了 BLI（图 4F）。这些数据表明 BA 的全身作用减少了肺转移并促进了 BART 对肺转移性疾病的远隔放疗作用，这种作用一直持续到研究结束。
6、BART 增加了 4T1 模型肺转移灶的 CD8 T 细胞，CD8 T细胞的耗尽消除了 BART 介导的作用
Ø BA 与同种型对照相比，转移性病变中 CD8 T 细胞的密度显着增加，BART 与 BA 或 RT 相比进一步增加（图4G 和 4H）。此外，BART 与 RT 相比，转移性肺病变中 CD8 T 细胞与 CD4 FoxP3 调节性 T 细胞 (Tregs) 的比率增加（图 4I）。然而，Tregs的密度治疗组间没有变化（数据未显示），表明 CD8/Treg比率随 BART 的增加是由 CD8 细胞数量的增加驱动的。
Ø 为了评估 CD8 T 细胞和 NK 细胞在受照射的原发肿瘤部位（乳房）与远处转移性肺病变的 BART 介导的免疫反应中的影响，在原位 4T1-luc 荷瘤中进行了基于抗体的免疫细胞消耗。BART 介导的原发性肿瘤生长抑制被 CD8 T 细胞 (p=0.0165) 或 NK 细胞 (p= 0.0291)的消耗部分取消（图4J）。相比之下，肺的对数转换 BLI（图4K）显示 CD8 T 细胞（p<0.0001）而非 NK 细胞（p=0.1401）的消耗显着消除了 BART 诱导的远隔效应。
7、BART 减少 4T1 模型中转移性肺中的PMN-MDSC
Ø 肺髓细胞浸润已被证明可促进 4T1 肺转移性疾病，并且是患有 4T1 肿瘤的小鼠的共同特征。我们观察到与非荷瘤对照肺相比，用同种型对照治疗的 4T1 荷瘤小鼠肺中的细胞数量增加（图 4L）。在 RT 后第 7 天，BA 或 RT 与同种型对照相比，4T1 荷瘤小鼠肺中的有核细胞平均数量略有减少，而 BART 则显着减少（图 4L 和 4M）。
Ø 流式细胞术分析表明，虽然多形核（PMN）-MDSCs 在非荷瘤小鼠肺部总免疫细胞中所占比例相对较小，但它们在荷瘤小鼠肺部总免疫细胞中所占比例较大。与先前报道的观察结果一致，即在 4T1 疾病进展期间肺 PMN-MDSC 浸润增加。BART 减少了 4T1 荷瘤小鼠肺中的总活细胞（图 4N），并显着减少了 PMN-MDSC 的总数（图 4O），而单一疗法均未显着减少总活细胞或 PMN-MDSC。
Ø 我们还观察到，在 4T1 荷瘤小鼠的整个肺中，BART 或 RT 与同种型对照相比，单核细胞 (M)-MDSCs 显着减少（图 4P)。与患病肺中 PMN-MDSCs 比例的大幅增加相反，M-MDSCs 在肺中占总细胞的比例要小得多（图 4N 和 4P）。
Ø 综上所述，这些数据表明BART 具有协同活性，其中 BA 进一步增强或补充了 RT 的积极作用，例如 I型干扰素反应、白细胞流入增加、抗原呈递/T 细胞库和抗血管生成作用。此外，BA 逆转了负面的 RT 效应，导致 TME 的局部重编程和增强的免疫反应（图 5A ）。
Ø BA 和局部肿瘤放疗的 TME 重编程形成有效的原位肿瘤疫苗，打破肿瘤免疫耐受，有效根除肿瘤并增强远隔效应对抗预先确定的自发性肺转移。这种远隔效应归因于细胞毒性 CD8 T 细胞的流入和激活增强，以及转移前肺生态位中免疫抑制性 Tregs 和骨髓细胞群（M-或 PMN-MDSC）的减少（图5B）
8、既不是TGF-b陷阱，也不是抗PD-L1，而是BA在RT介导的组织重塑的典型模型中减弱晚期RILF
Ø 典型的实验性 RT 诱导的肺纤维化 (RILF) 模型用于评估 BA 对RILF的治疗影响(图 6A )。放疗后第 16 周和第 24 周的临床计算机断层扫描 (CT) 扫描显示，第 0 周放疗和第 16 周同种对照（称为同种对照）的小鼠肺实质密度显着增加，以平均 Hounsfield 单位衡量。HU)，并且与第 0 周未用 RT 治疗的年龄匹配的参考小鼠相比，分段肺区域内的肺体积减小（图6B)，表明肺组织重塑。与同种型对照、TGF-β 陷阱或抗 PD-L1 相比，BA 显着降低肺密度。与这些发现一致，BA 与同种型对照、TGF-β 陷阱或抗 PD-L1 相比，总肺体积得到保护（图6C 和 6D）。使用纤维化指数 (FI) 模型，我们发现 BA 与同种型对照 或TGF-β 陷阱或抗 PD-L1 相比，肺纤维化显着减少（图 6E）。血气分析用于评估肺功能和肺纤维化状态对治疗剂或单独放疗的反应程度（图6F、6G）。肺功能，包括 pH、混合静脉氧饱和度(SvO 2 ) 和血红蛋白 (Hb) 受到 BA保护，与同种型对照、TGF-β 陷阱或抗 PD-L1 对比（图 6F-6H）。BA 与抗 PD-L1 相比，观察到部分二氧化碳 (PCO2) 水平的积累显着降低，并且 BA 后的 pH、SvO 2、PCO 2浓度和 Hct水平与年龄匹配的对照比同型对照更相似（图 6F、6G）。
Ø 在该模型中，RT 后第 24 周，肺组织的 H&E 染色显示肺泡隔增厚和炎症细胞浸润，酸性品红橙 G (AFOG) 染色显示同种型对照组中胶原含量增加（图 6I 和 6J）。相比之下，BA 观察到正常肺结构（图 6I），与同种型对照、TGF-β 陷阱或抗 PD-L1 相比，BA 降低实质肺密度（图6K），减少胶原沉积（图 6K， 6L)，肺泡密度增加（图 6M）和肺泡直径增加（图 6N)，表明肺泡正常化。
9、肺中具有高水平 TGF-β和 PD-L1 的细胞群在 RT 后增加，在 BA 治疗后减少
Ø 单细胞RNA-seq (scRNA-seq) 在用 RT 或 BART 处理的小鼠肺和未处理的对照肺上进行(图7A)。(B-I) RILF中鉴定的细胞簇中纤维化相关基因的表达；J:显示RILF亚集群精细结构去卷积的t-SNE图，根据(A)进行颜色编码。K:RILF每个集群中的TGF-b1阳性(绿色)和PD-L1阳性(蓝色)细胞(计数> 0彩色)。L:以Cd44、骨桥蛋白(SPP1)、MRC1(CD206)、Ear2、Chil3 和 Lpl (COME2Chil) 表达为特征的 M2 和 LF 样细胞的小提琴图。
Ø 我们的数据表明 RILF 中表达 TGF-β 和 PD-L1 的细胞仅限于 EC 和 LF 细胞（图 7 M）。有趣的是，LF(0)、B/T(6) 和 EC(13) 子簇在 RT 组富集 ，但在 BART 组减少（图 7 N 和 7O）
Ø 为所有 EC 簇 (1, 13) 确定的标记是 Cdh5 和 Pecam1（图 7P）。进一步建立的细胞周期停滞和衰老标志物如Cdkn2a仅在亚群 1b 中表达。只有 1c 缺乏 CD34 表达，而Sparc表达水平在集群 13 中特别高。t-SNE 和基于图的聚类分析在 RT 后将 EC 群体分为 10 个子集群（EC0 到 EC9），而在 BART 后，EC以在参考肺中发现的相似模式聚集在一起（图 7 Q 和 7R）。
Ø 总之，这些数据表明 RILF 中的 TGF-β 表达仅限于表达 PD-L1 的 COME2ChilL 细胞，具有 M2 和 LF 样表型以及 EC 亚群。BA 可以通过其抗 PD-L1 部分将 TGF-β 陷阱靶向相关源细胞。因此，在辐照肺中 BA 后发现相应细胞群的表型逆转，ECM 沉积减少和组织重塑过程减弱（图7S）。
❀ 研究小结 ❀
Ø 通过联合靶向PD-L1/TGFβ（BA）协同 RT 介导肿瘤微环境重编程和免疫激活从而治疗耐药性肿瘤。BA 对 RT 诱导的肺纤维化有明显的改善作用。临床转化 BART 可以克服固有的和获得性的肿瘤抵抗，同时减少正常组织的晚期毒性。
❀ 研究点评 ❀
· 研究优点：
1、运用4种冷肿瘤模型多方面验证RT联合BA后的疗效；增效、减毒的两个小故事独立又互相联系；
2、BA 与 RT协同通过 TME 重编程克服肿瘤免疫逃避，利用 BA-RT 重建肿瘤免疫监测系统诱导抗原效应，既阐明BA的机制也阐明RILF的机制；
3、在纤维化的肺组织中，PD-L1 内皮细胞和 M2 样脂肪成纤维细胞表达TGFβ，BA 通过中和 PD-L1 相关组织中的TGFβ而减轻肺纤维化；
4、示意图、总结图美观清晰。
· 疑问与不足：
1、从动物模型中的抗肿瘤疗效到结果二中对副作用的缓解缺乏过度，并未提到在小鼠中观察到肺炎的情况？
2、对筛选发现的cluster3相关基因GZMA, IL2RA, and NKG7未深入研究；
3、前后放疗的剂量不一致，从 5Gy 变为10Gy；
4、对 MDSC 有影响，但是未使用相关验证手段。
· 启发：
1、提示在间质性肺炎课题中可以增加考察α-SMA等相关指标，组织损伤修复过程中大量此类蛋白表达增加；
2、Micro-CT的应用；
3、与文献肿瘤模型样本测序数据与造模进行放疗后3天的数据进行配对研究？（参考table S1）
4、参考TME 重塑和免疫激活的panel（图3）。
❀ 参考文献 ❀
Lan Y, Moustafa M, et al. Simultaneous targeting of TGF-β/PD-L1 synergizes with radiotherapy by reprogramming the tumor microenvironment to overcome immune evasion. Cancer Cell. 2021 Sep 7:S1535-6108(21)00448-7.