从调节卵泡凋亡探讨左归丸治疗免疫性卵巢早衰的机制

目的： 为了进一步探讨左归丸防治POF的作用和机理，完善左归丸防治POF的系列研究，为理论研究和临床研究提供实验数据，本研究运用现代科研方法，结合病理学和分子生物学知识，从细胞凋亡方面，深入探讨左归丸对免疫性POF的作用机理。 方法： 1．文献研究：复习了中西医对POF的认识、治疗现状、研究现状以及左归丸对POF作用机理的研究进展，特别是对免疫系统作用的研究进展，并对左归丸对POF免疫系统的作用途径进行了分析和探讨，制定出从卵泡凋亡方面深入探讨左归丸防治POF作用机理的实验研究方案。 2．建立免疫性POF动物模型：用小鼠透明带多肽ZP3第330-342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)为免疫原建立自身免疫性POF小鼠模型，该模型在卵巢形态学的表现与人类POF自身免疫性卵巢炎相似。 3．模型动物被随机分为左归丸低、中、高剂量组，(?)，强的松组，己烯雌酚组和模型组。实验以强的松和己烯雌酚作为对照西药；以未造模的正常小鼠作为空白对照组。 4．观察各组小鼠的性周期和卵巢形态学的变化； 5．用电子天平测量各组小鼠用药前后的体重，以及用药后各组小鼠的卵巢重、脾重、胸腺重量，比较其重量指数； 6．用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠外周血中FSH和E_2水平； 7．用流式细胞仪检测外周血CD_4~+、CD_8~+、CD_3~+、CD_4~+／CD_8~+和NK细胞的含量； 8．用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠外周血中AZAb的含量； 9．用免疫组化法检测小鼠外周血中Fas-L和Bcl-2蛋白的含量； 10．用端口末端标记法(TUNEL)检测卵巢凋亡细胞，计算出凋亡率并比较。 结果： 模型组： 1．性周期：逐渐表现为动情周期紊乱，动情间期延长，阴道细胞涂片主要表现为大量白细胞及少量上皮细胞； 2．卵巢形态：卵巢间质可见较多淋巴细胞及浆细胞浸润，成熟卵泡少； 3．FSH明显升高，E_2明显下降； 4．体重指数降低，卵巢重、胸腺重量指数降低，脾重指数增加； 5．CD4~+、CD8、CD4~+／CD8~+比值下降，CD_3~+增加，NK细胞数量增加； 6．AZAb阳性，水平升高； 7．Bcl-2明显降低，Fa-L明显升高； 8．细胞凋亡率明显升高。 左归丸中药组：POF小鼠上述情况均有不同程度改善，具体表现为： 1．性周期：动情周期轻度紊乱，动情间期稍较长，主要为动情前期，阴道细胞涂片主要表现为有核上皮细胞，也有部分角化细胞，但略少于正常对照组、佐剂组和己烯雌酚组。 2．卵巢形态：少量淋巴细胞及浆细胞浸润，但卵巢中的发育及成熟卵泡较多。 3．FSH明显降低，E_2明显升高，其中以左归丸低、高剂量组明显； 4．体重指数轻微增加，卵巢重、胸腺重量指数明显升高； 5．CD4~+、CD8、CD4~+／CD8~+比值轻微升高，NK细胞数量明显减少，CD_3~+减少； 6．AZAb水平明显下降； 7．Bcl-2明显增多，Fa-L明显减少； 8．细胞凋亡率明显下降。 这些结果均显示：本实验制作的免疫性POF动物模型与文献报导的一致，证明造模成功。左归丸对免疫性卵巢早衰动物的卵巢功能、免疫功能具有一定的改善作用。特别是它能提高体内E_2水平，降低FSH升高，有效抑制AZAb产生，改善免疫性POF小鼠卵巢免疫性的炎症损伤，使卵巢出现较多的发育及成熟卵泡，卵巢间质淋巴细胞浸润减少。

结论： 1、本研究以小鼠透明带ZP3第330-342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)为免疫原建立自身免疫性POF小鼠模型，该模型在卵巢形态学的表现与人类POF自身免疫性卵巢炎相似。通过对模型小鼠性周期、FSH、E_2、卵巢细胞形态、卵巢重量指数、脾重指数、胸腺重指数、体重指数、CD_4~+、CD_8~+、CD_3~+、CD_8~+／CD_4~+、NK细胞、AZAb、Fas-L、Bcl-2、细胞凋亡率等指标的检测和观察，证实造模成功。 2、通过对卵巢形态学和生殖内分泌学的研究，证明左归丸对自身免疫反应所致的卵巢炎和卵巢功能衰退有改善作用，使卵巢重量指数显着增加，卵巢有生机卵泡增多，淋巴细胞和浆细胞浸润减少。并上调E2水平，从而降调FSH水平，性周期表现为动情间期延长，其中以左归丸低、高剂量组明显。

3、左归丸对自身免疫性POF小鼠模型免疫功能具有调节作用。使胸腺重量指数上升，AZAb效价下降，NK细胞数量减少，从而抑制自身免疫性损伤。 4、左归丸具有抑制Fas介导的卵泡细胞凋亡的作用。使Bcl-2明显增加，Fa-L明显降低，细胞凋亡率明显下降。...