背景
肺癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，2018年估计有210万例和180万人死亡。根据临床统计分析，肺癌患者中有80-85%被归类为非小细胞肺癌(NSCLC)。尽管目前在非小细胞肺癌(NSCLC)治疗方面取得了不少进展，但治疗结果仍然很差，主要原因仍是由于治疗的耐药性或毒性。erastin作为一种铁死亡诱导剂，在包括NSCLC在内的各种类型癌症中都表现出良好的细胞毒性作用。雷公藤红素是一种从雷公藤中提取的三萜化合物，具有潜在的抗癌活性，但产生的副作用十分严重，限制了其临床应用。联合治疗是当前很有前途的一种治疗手段，可用来克服补偿机制和不必要的非目标效应。在本研究中，作者发现erastin与雷公藤红素协同诱导无毒浓度的细胞发生死亡，同时两者的联合治疗显著增加了ROS的产生，破坏了线粒体膜电位，并促进了线粒体分裂。此外，erastin与雷公藤红素联合治疗引发了ATG5/ATG7依赖的自噬、PINK1/帕金依赖的有丝分裂和HSF1依赖的热激蛋白(HSP)的表达。HSF1的敲除进一步增强体外细胞死亡，抑制了体内的肿瘤生长。研究结果表明，erastin与雷公藤红素联合治疗可能是NSCLC患者新的治疗方案，并值得进一步的临床评估。
实验内容
一、erastin与雷公藤红素联合治疗诱导NSCLC细胞死亡
实验首先将不同的NSCLC细胞系在梯度浓度递增的erastin或雷公藤红素下治疗了24小时。CCK-8分析结果表明，在HCC827、H1299和A549细胞中，erastin或雷公藤红素以剂量依赖的方式降低了细胞生存能力(图1A,B)。为了确定erastin与雷公藤红素联合治疗的细胞毒性作用，接下来实验治疗了不同浓度组合的HCC827、A549和H1299细胞，并检查了细胞可行性和细胞毒性。有趣的是，结果发现低浓度的erastin与雷公藤红素联合治疗会显著降低细胞活力并诱导细胞死亡。但其两者中任何一种治疗都不会对这些细胞产生显著的细胞死亡影响(图1C，D)。为了证明两者间的协同作用，作者采用了Calcusyn软件以生成组合索引(CI)图。结果表明，所有实验点的CI值均为<1，表明erastin与雷公藤红素在NSCLC细胞中具有高度协同作用(图1E,Table1)。值得注意的是，HCC827细胞对两者共处理高度敏感，因此选择2.5µMerastin和1.25µM雷公藤红素进行进一步实验来评估这两种药物的潜在协同效应(图1C,D)。发现erastin或雷公藤红素的单一治疗对HCC827细胞的细胞形态和菌落的形成没有影响，但联合治疗却显著改变了细胞的形态，阻止了菌落的形成(图1F-H)。表明erastin与雷公藤红素在体外对NSCLC细胞有很强的协同抗癌作用。
二、erastin与雷公藤红素联合治疗不能诱导细胞凋亡或铁死亡
为了确定erastin与雷公藤红素的协同作用是否依赖于细胞凋亡，实验通过流式细胞法检查了细胞凋亡的百分比。由抗连接蛋白V/PI阳性染色的结果表明，这两种药物无论是单独使用或联合使用，对细胞凋亡均无显著影响(图2A)。接着实验采用凋亡抑制剂Z-VADFMK治疗HCC827细胞，发现Z-VAD-FMK不能减轻erastin与雷公藤红素诱导的细胞死亡(图2B)。同时，共处理的过程中半胱甘蛋白酶3的表达和Bax/Bcl-2的比率均未增加(图2C)。这些结果均表明，erastin与雷公藤红素的联合治疗并不能促进HCC827细胞的凋亡诱导，说明erastin与雷公藤红素联合治疗并不能诱导细胞凋亡。由于erastin是经典的铁死亡诱导剂，因此实验研究了雷公藤红素是否使细胞敏感于erastin诱导的铁死亡。令人惊讶的是，erastin与雷公藤红素的联合治疗并不会增加脂质ROS的产生和脂质过氧化作用(图2D)。同时关键的铁死亡相关蛋白，包括GPX4和SLC7A11，在共处理期间的表达均没有减少。铁死亡的发生依赖于铁的积累，可以通过铁螯合剂来预防。然而，在erastin与雷公藤红素的联合治疗下，细胞的铁含量显著降低(图2E)。事实上，补充铁螯合剂DFO或DFX进一步增强了两者共治疗的致死力(图2F)。为了进一步研究铁的作用，实验研究了铁相关蛋白表达的变化。负责从细胞中转移铁的铁孔蛋白（FPN1）通过联合处理上调，导致储存细胞中铁的FTH和FTL也上调了(图2G)。
三、erastin与雷公藤红素联合治疗诱导ROS依赖性自噬
虽然脂质ROS水平没有改变，但erastin与雷公藤红素联合治疗的细胞内ROS水平显著升高(图3A)。为了评价ROS在联合治疗中的作用，用erastin与雷公藤红素联合治疗NAC（一种ROS的清除器）。结果发现，NAC治疗完全抑制erastin与雷公藤红素联合治疗诱导的细胞死亡，表明ROS在erastin与雷公藤红素联合治疗的细胞毒性作用中起关键作用(图3B)。ROS水平的增加刺激细胞自噬，因此，接下来将研究在共治疗后细胞是否开始自噬。发现共处理24h后，HCC827细胞中LC3穿刺点数量显著增加(图3C)。同时，实验观察到erastin与雷公藤红素联合治疗后LC3-I到LC3-II的转换显著增加。此外，自噬相关标记物的蛋白水平包括Beclin-1，ATG5，ATG7和SQSTM1/p62，在erastin与雷公藤红素联合治疗下显著上调(图3D)。NAC治疗极大地抑制了这些自噬相关基因的上调表达和LC3点的形成，表明细胞自噬开始强烈依赖于ROS(图3E,F)。为了进一步证实自噬细胞依赖性细胞死亡，实验通过基因鉴定了自噬细胞的必需基因ATG5或ATG7。与作者的推测一致，LC-3II表达减少，降低ATG5和自噬小泡7的表达，显著抑制了自噬(图3G-H)。ATG5和ATG7的减少也减轻了24小时erastin与雷公藤红素联合治疗后细胞活力的丧失和增加的细胞死亡(图3I)。此外，实验还使用CRISPR-Cas9系统生成了一个稳定的ATG5敲除基因(ATG5-KO)细胞系(图3J)，发现ATG5的敲除在erastin与雷公藤红素联合治疗后显著缓解了细胞活力的降低和细胞死亡的增加(图3K,L)。同时，ATG5的敲除也部分挽救了erastin与雷公藤红素联合治疗后的菌落形成(图3M)，而ATG5的过度表达加强了自噬的过程，并加剧了erastin与雷公藤红素诱导的细胞死亡(图3O,P)。综上结果表明，ATG5/atg7介导的自噬是erastin与雷公藤红素诱导的细胞死亡所必需的。
四、erastin与雷公藤红素联合治疗破坏线粒体膜电位，诱导线粒体功能障碍
因为线粒体是ROS的主要来源，并且对氧化应激很敏感，所以接下来研究了erastin与雷公藤红素对线粒体功能的影响。由图4A所示，混合物SOX染色显示erastin与雷公藤红素显著提高线粒体ROS水平。虽然分别加入两者均能稍微降低线粒体膜电位和质量，但它们的结合大大增强了这种效果(图4B,C)。而且，在两者的共同治疗下，线粒体拷贝数也显著减少(图4D)。为了进一步确定对线粒体的损伤，实验使用TEM来观察HCC827细胞的超微结构变化。发现在erastin与雷公藤红素的联合治疗下，线粒体在HCC827细胞中呈现出完整的缺陷和正常的形态特征，但在细胞中出现肿大，缺乏破裂的缺陷(图4E)。说明erastin与雷公藤红素联合治疗可以诱导线粒体膜电位的去极化，增加ROS水平，从而导致受损线粒体的积累。
erastin与雷公藤红素联合治疗显著增加了刺点和短线粒体的数量，并减少了管状线粒体的数量。为了解剖线粒体分裂在erastin与雷公藤红素诱导的噬细胞中的作用，作者研究了shRNA介导的DRP1敲除的作用。DRP1的敲除显著抑制了erastin与雷公藤红素共处理诱导的线粒体分裂，这可以通过对线粒体细长杆状结构的恢复来证明(图5A)。DRP1敲除抑制了erastin与雷公藤红素联合治疗后线粒体PINK1和帕金表达的增加和泛素蛋白水平的增加(图5E,F)。重要的是，DRP1的沉默显著阻断了两者共处理诱导的细胞死亡，表明DRP1抑制衰减了线粒体分裂和细胞死亡(图5G,H)。结果表明erastin与雷公藤红素诱导的噬细胞是由上游DRP1调节线粒体分裂过程介导的。
五、erastin与雷公藤红素联合治疗后，P38与DRP1相互作用并磷酸化
据报道，p38通过促进硒616的磷酸化来调节DRP1的活性从而诱导线粒体破裂。由实验发现，erastin与雷公藤红素联合治疗后，Ser616的DRP1磷酸化增加(图6A),p38和DRP1之间的相互作用显著增加(图6B)。此外，实验使用特异性抑制剂SB203580在药理学上抑制了p38的活性。SB203580阻断了Se616处DRP1的磷酸化，抑制了FIS1和MFF的表达(图6C)。然而，与SB203580或SB202930共育能进一步增强了erastin与雷公藤红素共治疗引起的细胞死亡(图6D)。这些结果表明DRP1并不是p38的唯一底物，而且p38可能在erastin与雷公藤红素治疗期间调节其他靶点或途径来促进细胞生存。
六、对HSF1的抑制作用加重了erastin与雷公藤红素联合治疗诱导的细胞死亡
蛋白质稳态的干扰是导致细胞死亡的另一个原因，热休克蛋白(HSP)是结构表达和/或应激诱导分子，它们不仅在新生蛋白中显示伴侣活性，而且是细胞应激后的补救作用。而erastin与雷公藤红素共处理明显提高了这些HSP的蛋白质水平(图7A)，为了研究HSF1在调节HSP表达中的作用，用两种不同的sHRNA抑制HSF1。发现HSF1的敲除不仅降低本构HSP表达，而且显著抑制erastin与雷公藤红素联合治疗后的HSP诱导(图7B)。同时，使用HSF1抑制剂KRIBB11治疗也能显著地阻止了HSP的表达(图7C)。KRIBB11或三吡酯对HSF1的抑制进一步降低细胞生存能力，加剧细胞死亡(图7D)。另一个转录共激活因子BRG1，染色质重塑复合物的亚基，也显著增强。然而，HSF1的敲低极大地阻碍了这些招募到的HSP70启动子，表明HSF1促进了BRG1的表达以应对erastin与雷公藤红素联合治疗(图7I)。总之，这些结果表明，erastin与雷公藤红素联合治疗可以促进S326的磷酸化、HSF1的核易位以及招募HSF1到HSP启动子以扩增HSP诱导。
七、erastin与雷公藤红素联合治疗可以防止体内HCC827细胞的增殖
与体外结果相似，erastin与雷公藤红素联合治疗也增加了LC3-II、帕金、HSF1和HSP27在肿瘤组织中的表达(图8D)。在erastin与雷公藤红素治疗期间，在心脏、肝、脾、肺和肾脏中没有观察到明显的毒性迹象(图8E)。而体内的实验发现，在erastin与雷公藤红素联合治疗下HSF1敲除小鼠的肿瘤体积和重量进一步降低(图8F-H)。肿瘤组织中HSF1和HSP27蛋白水平的降低证实了敲除效率,而HSF1的沉默也降低了帕金和LC3-II的上调(图8I)。这些结果表明，erastin与雷公藤红素联合治疗对NSCLC具有抗癌作用，HSF1的抑制进一步增强了这种协同作用。
总结
实验发现低浓度erastin与雷公藤红素联合治疗通过激活ROS-线粒体分裂-噬细胞信号通路显著诱导细胞死亡，从而为erastin与雷公藤红素联合治疗在NSCLC的应用中提供了新的见解。其他研究应集中在潜在的临床试验上，以测试erastin与雷公藤红素联合治疗NSCLC患者的疗效。
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