非编码RNA（ncRNA）是一类不参与编码蛋白质的RNA，但是这类RNA具有调节基因表达和蛋白质功能的特性。非编码RNA的两大类别分别是短链的microRNA（miRNA）和长链的lncRNA。多项研究已表明，非编码RNA与多种复杂的生物过程有关，例如免疫细胞的发育和功能、免疫紊乱、神经发育和神经系统疾病。因此，非编码RNA的靶向治疗具有治疗各种疾病的希望。6月18日，美国MD安德森癌症中心的研究人员在Nature Reviews Drug Discovery上撰文讨论了非编码RNA疗法开发面临的主要挑战和解决方法。
来源：Nature Reviews Drug Discovery
迄今为止，FDA、EMA已批准了11种RNA疗法（表1），这些疗法靶向肝脏、肌肉或中枢神经系统进行基因修饰，主要类型有下调特定基因的小干扰RNA（siRNA）或反义寡核苷酸（ASO），以及靶向前体mRNA剪接过程的ASO。
来源：Nature Reviews Drug Discovery
此外，还有大量RNA疗法处于临床II期或III期开发阶段，这其中包括较新的miRNA模拟物（miRNA mimics）和miRNA抑制剂（anti-microRNA）（表 2），而lncRNA疗法暂未进入临床。
来源：Nature Reviews Drug Discovery
首先，miRNA是人类细胞中天然存在的分子（图1），其次，miRNA能通过一条通路靶向多个基因。例如，miR-15–miR-16簇可下调包括BCL-2和MCL1在内的多种抗凋亡因子。因此，与仅能影响单个靶基因的siRNA或ASO相比，使用miRNA或靶向miRNA的疗法可能是现有RNA疗法的潜力替代疗法，而且这种疗法还有可能提高治疗的效果。
miRNA生物发生途径和进行治疗性干扰的方法（来源：Nature Reviews Drug Discovery）
而lncRNA有着多种功能库，对lncRNA的靶向作用可能包括转录抑制、转录后抑制、二级结构形成或蛋白质相互作用的空间位阻等。无论是非编码RNA，还是在研的比较成熟的ASO和siRNA疗法，所有基于RNA的疗法在临床转化中都需要克服来自疗法特异性、递送和耐受性等方面的阻碍。免疫系统通过不同的胞外和胞内PAMP（pathogen-associated molecular pattern）受体识别单链（ss）和双链（ds）RNA，这是机体的一种病毒防御机制。胞外识别由内体中的TLR 3、7和8介导，胞内识别由细胞质中的受体介导。识别RNA疗法的主要途径是TLR信号传导，它通过髓样分化因子88（MyD88）介导并激活各种途径，导致核因子-κB（NF-κB）激活和促炎细胞因子（IL-6、IL-8、IL-12和TNF）或I型干扰素反应，最终导致多种下游免疫应答的激活。miRNA对TLR7和TLR8的刺激依赖于富含GU的序列（例如5'-UGUGU-3'或5'-GUCCUUCAA-3'）的存在，而且会引起IFNα介导的炎症反应，激活树突状细胞和巨噬细胞中NF-κB和炎性细胞因子的生成。此外，单链RNA比双链RNA更容易引起免疫刺激，因此，目前临床使用或开发中的所有siRNA药物都是双链的（表1，2）。现在RNA疗法中普遍使用了第二代化学修饰，来降低RNA疗法的免疫刺激可能性。例如siRNA上的2'-核糖修饰可以消除TLR刺激。第三代修饰，例如吗啉反义寡核苷酸（PMO）可以通过中和小RNA药物的电荷来进一步降低免疫原性，从而阻止它们与蛋白质的相互作用。尽管在解决RNA疗法的免疫原性问题上取得了一些进展，但免疫原性障碍仍需更深的探索。下面是一些可能的解决方案：由于TLR的有效激活需要长度至少为21个核苷酸的单链RNA，因此设计更小的RNA疗法或许可以规避疗法的免疫原性。例如，锁核酸（LNA）是一种被7-8个核苷酸短序列修饰的miRNA抑制剂（antimiR），靶向miRNA的5'-种子区域，可以拮抗和抑制共享该种子序列的整个miRNA家族。在小鼠癌症模型中注射微小LNA显示出了抗肿瘤作用，而且在小鼠心脏应激模型中注射靶向miR-34的微小LNA还改善了心脏参数，这些结果是抑制单个miR-34家族成员所无法实现的。与节拍化疗类似，将节拍RNA疗法定义为在长时间内定期、多次施用有限的药物剂量，以达到虽低但有效的剂量范围，而不会引起过度的毒性或免疫原性。对患有转移性HER2阳性乳腺癌的老年患者，在曲妥珠单抗加帕妥珠单抗的药物组合中加入节拍环磷酰胺显著延长了患者的无进展生存期。在数月内连续进行RNA疗法的给药应该也可以达到类似的结果，但是需要注意的是，为了安全地执行节拍RNA疗法，还需要进行大量的药效学和药代动力学研究。联合疗法可用于减少RNA疗法所需的剂量，从而降低免疫原性。例如与化疗、放疗、小分子疗法以及免疫疗法的联合使用。RNA联合疗法开发中还有一个有趣的方法：开发能够同时递送多个小RNA的合成RNA分子。例如，基于tRNA-pre-miR-34a这个载体开发的组合式RNA CO-BERA可以同时递送NRF2–siRNA、anti-miR-21-5p、let-7c-5p、miR-124-3p和miR-34a-3p，这种siRNA、miRNA抑制剂和miRNA模拟物组合在体外成功抑制了多种肺癌细胞系的生长。RNA药物的质量主要取决于药物对靶点的特异性强度和存不存在脱靶效应。RNAi药物设计的发展已经提高了靶向特异性并减少了不需要的脱靶效应，但对非编码RNA药物尚未进行充分的研究。RNA药物剂量是影响药物质量的另一个重要的因素。当使用miRNA模拟物和抑制剂时，剂量有额外的影响。一方面，miRNA靶向多种不同的mRNA；另一方面，每个mRNA靶点都受多个miRNA的调控，并且可能在附近拥有不同的miRNA结合位点，从而导致结合竞争。如果miRNA以竞争方式与靶点相互作用，单个miRNA水平的扰动将影响其他miRNA对mRNA的靶向。miRNA或miRNA抑制剂在非靶细胞中过度表达可能具有毒性，想要限制这种表达可以使用能被目标细胞中过度表达的某种启动子控制的载体来递送RNA药物。例如，MYCN是神经母细胞瘤中的致癌基因，将miRNA克隆到MYCN启动子控制下的载体中，可以实现治疗性miRNA在神经母细胞瘤细胞中的选择性表达。如果这一载体进入几乎不表达MYCN的非神经母细胞瘤细胞，则miRNA的表达将是最小的。需要注意的是，这种细胞特异性miRNA调节尚未在临床上应用，使用这种方法时应密切监测药物剂量。如果miRNA或lncRNA在患病细胞类型中特异性地过度表达，而在正常细胞类型中低表达，则可以应用“假”细胞特异性靶向。假定正常细胞中低表达转录物的下调不会产生强烈的不利影响，大部分lncRNA在正常细胞中以非常低的水平表达就是这种情况，因此反义疗法对正常细胞几乎没有影响（因此没有毒性）。这种方法的临床应用需要对准确的非编码组织表达模式进行细致的临床前研究，尤其是一些非保守的、灵长类或人类特异性的转录本。环状RNA比线性RNA要稳定得多，许多环状siRNA不仅更稳定，而且介导的RNAi效应更有效，持续时间更长。环状化似乎克服了多个线性siRNA的障碍，表现出更低的免疫刺激、更高的稳定性和生物利用度，以及更高效的细胞摄取。环状lncRNA（circRNA）的发现进一步拓宽了阻断致癌RNA功能的可能性。多项研究表明circRNA的失调与癌症、糖尿病和动脉粥样硬化等多种疾病有关。因此，内源性或合成的circRNA有可能被用作有效且高度稳定的疗法。RNA疗法领域还有一个重要的难题，就是将RNA药物有效地递送至靶器官和靶细胞，并跨细胞膜执行药物的细胞内功能，此前许多RNA疗法临床试验被迫终止的主要原因就是药物的疗效不足（表3）。
来源：Nature Reviews Drug Discovery寡核苷酸药物的有效递送受制于寡核苷酸的不稳定性、负电荷和亲水性等特性。第一代和第二代化学修饰通过诱导对核酸酶降解的抗性和增加与蛋白质的相互作用来提高稳定性和吸收率。第三代反义技术（如带中性电荷的PMO）高度稳定，但细胞摄取困难，因而需要高剂量给药。为了解决寡核苷酸的递送难题，多种递送系统现已被开发出来，第一种最常用的是脂质纳米颗粒（LNP），具有修饰难度低、高生物降解性、生物相容性以及低免疫原性的特点。另一种应用比较广泛的递送方式是将寡核苷酸与各种实体进行偶联，研究最广泛的是配体偶联，通过受体介导的机制进行选择性递送，也是将RNA药物递送至肝细胞的主要临床策略。N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）是肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体（ASGR）的高亲和力配体，可介导网格蛋白介导的内吞作用，GalNAc偶联递送在肝靶向递送领域十分具有优势，Ionis Pharmaceuticals开发的用于治疗非酒精性脂肪性肝炎和2型糖尿病的miRNA药物RG-125也采用了这种递送方式，目前正在临床I/II期试验（NCT02612662）中进行测试，在研的许多RNA疗法也都采用了这种递送方式（表1，2）。此外，寡核苷酸与抗体的偶联也具有良好的临床前发展前景。RNA与抗体的偶联可以通过静电相互作用、生物素或亲和素的亲和偶联、直接偶联或双链杂交来实现。除了这些递送方式外，作者还总结了两种有希望用于临床转化的递送方式：外泌体是细胞分泌的微小（纳米级）囊泡，通过递送不同类型的“货物”，例如蛋白质、脂质和核酸等，参与细胞间通讯。由于外泌体的抗原性可忽略不计、细胞毒性极小以及它们绕过内吞途径和绕过吞噬作用的能力，因此外泌体可能是一种理想的miRNA递送系统。尽管使用外泌体进行递送很有前景，但外泌体的大规模生产成本高昂，在商业可行性方面较难拓展。多项研究证明了噬菌体是一种安全有效的递送工具，与其它递送载体和药物一样，较强的渗透能力和滞留效应使得噬菌体主要积累在肝脏、脾脏以及实体瘤中。目前，噬菌体作为抗菌剂在临床试验中得到了广泛的研究，但作为RNA药物的载体还尚未得到充分研究，这可能是由于噬菌体缺乏天然的内化和内体逃逸机制。细菌微细胞（bacterial minicell）是由细菌装配的微小囊泡，不含染色体。目前处于临床I期的MesomiR-1（NCT02369198）是第一项细菌微细胞的人体研究，使用了一种无生命特征的细菌微细胞对miR-16模拟物进行递送，用于治疗非小细胞肺癌或恶性胸膜间皮瘤患者。因为细菌具有多种天然的内体逃逸机制，因此这种递送方法可能更有利于实现细胞内递送。RNA疗法的成功应用需要跨多学科的技术进步，包括分子生物学、免疫学、药理学、化学和纳米技术等。尽管具有挑战性，但随着多项临床前研究涌现出新的、创造性的进步，RNA疗法领域所面临的困难终将被克服。[1] Winkle, M., El-Daly, S. M., Fabbri, M.et al. Noncoding RNA therapeutics — challenges and potential solutions. Nature Reviews Drug Discovery (2021)
