MPB：中科院深圳先进院戴磊组小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测
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小鼠粪便样本中16S拷贝数的定量检测
Quantitative Analysis of 16S rRNA Gene Copies in Mouse Fecal Sample
刘红宾1*，吕青青1，戴磊1
1.中国科学院深圳先进技术研究院，深圳，广东省
*通讯作者邮箱：binhongliu@126.com
摘要：16S rRNA基因和宏基因组测序技术是研究肠道菌群结构与功能的重要手段，由此可以获取微生物群落的结构和功能组成信息；然而，二者得到的数据均为相对丰度类型，大大削弱了不同样品间的可比性，也难以揭示生物量水平的菌群结构和功能变化。本文旨在运用实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR）技术对小鼠粪便中的16S rRNA基因进行定量检测，为准确分析肠道菌群的结构提供技术参考。
关键词：16S rRNA基因，绝对定量，肠道菌群
材料与试剂
试剂：
1.高保真酶（PrimeSTAR，TAKARA，R045A）
2.TB Green酶（TAKARA，RR820A）
3.Omega胶回收试剂盒（Omega，D2500-01）
4.琼脂糖
5.引物（27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1541R-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA ；331F-TCCTACGGGAGGCAGCAGT，797R-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT）[1]
仪器设备
1.Nanodrop 2000
2.电泳仪
3.普通PCR仪（Bio-read）
4.荧光定量PCR仪（Bio-read）
实验步骤
A.全长16S rRNA基因标准品制备
1.全长16S rRNA基因扩增
PCR扩增体系：
|
试剂 |
浓度 |
体积 （μl） |
|
PrimerSTAR |
- |
25 |
|
27F |
2 μM |
5 |
|
1541R |
2 μM |
5 |
|
小鼠粪便DNA |
60-80 ng/μl |
1 |
|
ddH2O |
14 |
PCR扩增程序（30个循环）：
|
98 °C |
5 min |
|
98 °C |
10 s |
|
55 °C |
15 s |
|
72 °C |
15 s |
|
12 °C |
∞ |
2.全长16S rRNA基因扩增产物回收
按照胶回收试剂盒说明书，对PCR扩增产物进行回收，并利用Nanodrop对其浓度进行测定。
3.全长16S rRNA基因扩增产物拷贝数确定
举例：Nanodrop测得胶回收的16S片段的浓度为182 ng/μl，由于1,500 bp的16S核酸的分子量为5.1 x 105 ng/nmol（https://www.genscript.com/conversion.html），所以标准品中含有3.57 x 10-4 nmol分子，根据阿伏伽德罗常数计算1 μl标准品中含有2.14 x 1011个拷贝。
4.全长16S rRNA基因扩增产物梯度稀释
将标准品做10倍系列稀释, 使其形成109-104拷贝/μl。
B.16S rRNA基因拷贝数标准曲线的制备
1.全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测
Real-time PCR扩增体系：
|
试剂 |
浓度 |
体积 （μl） |
|
TB Green 酶 |
- |
10 |
|
331F |
4 μM |
1 |
|
797R |
4 μM |
1 |
|
全长16S rRNA 基因DNA标准品 |
梯度浓度 |
1 |
|
ddH2O |
7 |
PCR扩增程序（40个循环）：
|
98 °C |
3 min |
|
98 °C |
5 s |
|
55 °C |
30 s |
|
+ Plant Read |
|
|
72 °C |
30 s |
|
Melt curve 65 °C to 95 °C, increment 0.5 °C for 0:05 + Plate Read |
|
|
12 °C |
∞ |
2.构建16S rRNA基因梯度拷贝数标准曲线
以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标, 以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标得到标准曲线, 为待测样品的定量提供了定量检测的参照标准.
C.小鼠粪便DNA待测样品中16S rRNA基因拷贝数的定量检测
对小鼠粪便DNA待测样品，按照“全长16S rRNA基因梯度拷贝数标准品的定量PCR检测”中的程序与条件，进行real-time PCR检测。依据建立的标准曲线，计算出待测样品中的16S rRNA基因拷贝数。
结果与分析
下图1展示了溶解曲线、标准曲线和待测样品的检测结果。依据标准曲线方程，Ct值为8的小鼠粪便DNA样品中含有的16S rRNA基因拷贝数为10^（-0.2819 x 8 + 10.682）= 2.67 × 108个。
图1. RT-PCR方法检测粪便样本中微生物16S rRNA基因拷贝数熔解曲线和标准曲线
参考文献
1.Jian, C., Luukkonen, P., Yki-Jarvinen, H., Salonen, A. and Korpela, K. (2020). Quantitative PCR provides a simple and accessible method for quantitative microbiota profiling. PLoS One 15(1): e0227285.