农村发财致富赚钱技术之石斑鱼遗传多样性的研究

石斑鱼遗传多样性的研究

　遗传多样性(genetics diversity) 又称基因多样性(genes di2versity) 。它不仅是生物多样性的核心组成部分 ,而且是物种多样性和生态系统多样性的基础 ,也是生命进化和物种分化的基础 ,更是评价自然生物资源的重要依据。通常所说的遗传多样性是指种内不同种群之间或一个种群内不同个体之间遗传变异的总和 ,其表现是多层次、多水平的 ,主要包括表型多态、染色体多态、蛋白质多态以及 DNA 多态。鱼类遗传多样性是鱼类生存与遗传进化的基础。开展鱼类遗传多样性的研究不仅有利于渔业资源的管理与保护 ,而且为鱼类遗传育种提供科学依据 。

石斑鱼是重要的世界性海水经济鱼类 ,也是海水增养殖的对象之一。近年来 ,由于人类活动的不断加剧 ,掠夺性开发、过度捕捞、海洋环境的污染和破坏、养殖群体的近亲繁殖、外来种侵入等原因 ,鱼类资源日益衰退 ,许多重要的经济鱼类已经不再形成鱼汛 , 而且种质资源在不断退化 。石斑鱼的种质资源现状如何 ? 如何有效地保护与

开发 ? 这些问题都值得我们去探讨。本文分别从表型、染色体、蛋白质、DNA 四个层次上简要概述国内外石斑鱼遗传多样性的研究进展 ,以期为今后开展石斑鱼的种质资源保护和遗传育种提供参考。

1 　石斑鱼的种类、分布及生态概要

石斑鱼是石斑鱼属 ( Epinephelus) 鱼类的统称 ,在分类学上隶属于鲈形目 ( Perciformes) 、鲈亚目 ( Percoidei) 、　科 (Ser2ranidae) 、石斑鱼亚科(Epinephelinae) 。石斑鱼的种类较多 ,全世界已记录有 100 多种 ,我国记录有 46 种 ,常见的有赤点石斑鱼 ( Epinephelus akaara) ,青石斑鱼( E. awoara) 、点带石斑鱼( E. malabaricus) 、斜带石斑鱼 ( E. coioides) 、巨石斑鱼 ( E. tauvina) 、鲑点石斑鱼( E. f ario) 、云纹石斑鱼 ( E. moara) 、七带石斑鱼( E. septemf asciatus) 、鲑形石斑鱼 ( E. salmorroides) 、褐点石斑鱼 ( E. f uscoguttatus) 、小齿石斑鱼 ( E. microdon) 、条带石斑鱼( E. f asciatus) 、纳苏石斑鱼 ( E. striatus) 、棕点石斑鱼( E. suillus) 、鲈滑石斑鱼 ( E. laurina) 、宝石石斑鱼 ( E. areolatus) 、网纹石斑鱼 ( E. chlorostigma) 、小点石斑鱼( E. epistictus) 、布 氏 石 斑 鱼 ( E. bleekeri) 、指 印 石 斑 鱼 ( E.megachir) 、纵带石斑鱼 ( E. latif asciatus) 、镶点石斑鱼 ( E.amblycephalus) 、龙胆石斑鱼 ( E. lanceolatus) 等 。石斑鱼是暖水性、广盐性、岛礁性鱼类 ,生长的适宜海水温度为 22～30 ℃,以 24～28 ℃最适 ;适宜盐度为 11～41 ,以 20～32 最适。

主要分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域 ,我国主要分布在南海和东海南部。在自然环境中 ,石斑鱼喜欢生活在近海大陆架的多岛礁海区 ,栖息于珊瑚礁、岩礁的洞穴中 ,其 栖 息 具 有 明 显 的 地 域 性 , 而 且 有 集 群 繁 殖 的 特点。石斑鱼由于具有生长快、适应能力强、饲养成活率高、经济价值高等特点 ,已经成为重要的海水鱼类养殖对象 ,主要在中国、泰国、菲律宾等国沿海进行网箱养殖。目前已成功进行人工繁殖的种类有 13 种以上。James(1999) 等通过对 E. f uscoguttatus 与 E. polyphekadion 的杂交潜力研究 ,认为石斑鱼种间杂交是可以实现的 。Glamnzina 等 (2001)进行了 Epinephelus costae ×E. marginatus 的研究。和 Tseng 等 (1983)分别进行了 E. amblycephalus ×E. akaara 的研究 ;宋盛宪等 (1987)对赤点石斑 ( ♂) ×青石斑( ♀) 研究都取得初步成功。另外 ,石斑鱼也是人工放流增殖的鱼类之一。日本是目前石斑鱼人工放流增殖较成功的国家之一。在我国 ,薄治礼(2002) 等学者也进行过石斑鱼的放流试验。

近年来 ,由于过度捕捞 ,石斑鱼资源日益衰退 ,主要表现在雌雄比例、捕捞数量、个体大小、种群规模、种群年龄组成的变化上。石斑鱼网箱养殖群体也由于近亲繁殖等原因 ,种质问题不容忽视。有幸的是 ,国内外许多学者已认识到保护石斑鱼资源的重要性与紧迫性[13 ] 。

2 　石斑鱼遗传多样的研究概况

2. 1 　表型水平

从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老也是最简便易行的方法。通常所利用的表型性状主要有两类 ,一是符合孟德尔遗传规律的单基因性状 (如质量性状、稀有突变等) ,另一类是由多基因决定的数量性状 (如大多数形态性状、生活史性状) 。与其他生物相比 ,鱼类的性状是多变的 ,多数性状属于数量性状 ,而且我们对控制鱼类性状的基因了解不多。鱼类种内遗传变异是广泛、多水平的 ,体现在不同的地理种群间和群体内、不同个体间和个体内、不同性状在不同水平上的变异程度不同。石斑鱼的表型多样性丰富 ,主要体现在不同水平上的种群大小、地理分布、形态特征、生长发育、繁殖周期、产卵量、抗逆性等方面。石斑鱼形态多样 ,种类繁多 ,分布广泛 ,遗传多样性极其丰富。石斑鱼尾鳍的形状、体侧和鳍上斑点的颜色及形状大小、体侧有无横带或纵带及条带的数量和形状、胸鳍的长度等形态特征都是石斑鱼种类的主要分类依据。如网纹石斑鱼( E. chlorostigma) 尾鳍近截形、体侧和鳍上具小于瞳孔的六角形斑点;宝石石斑鱼 ( E. areolatus) 尾鳍凹形 ,体侧和鳍上具有大于瞳孔的六角形斑点; 赤点石斑鱼 ( E. akaara) 尾鳍圆形、体及奇鳍具有橙黄色斑、仅背鳍基底具有一大黑斑;鲑点石斑鱼( E. f ario) 体及奇鳍具红色斑、背鳍基底及尾柄具 3 个大黑斑; 体侧具纵带的是纵带石斑鱼 ( E. latif asciatus) ,体侧横带明显、边缘镶有黑斑的是镶点石斑鱼( E. amblycephalus) ,体侧横带不甚明显、由较大的斑点排列成带状的是点带石斑鱼 ( E. malabaricus) ; 云纹石斑鱼 ( E. moara) 体侧具有 6 条横带、各带多中断、前 2 条斜向前下方 ,而青石斑鱼( E. awoara) 体侧具有 6 条横带、各带不中断、前2 条横带不斜向前下方;小点石斑鱼 ( E. epistictus) 胸鳍长等于或小于眼后头长、体侧上半部具有稀疏黑斑 ,而指印石斑鱼( E. megachir) 胸鳍长大于眼后头长、体侧具有指印状大斑 。世界上石斑鱼种类有 100 个种以上 ,是鱼类中种质资源极其丰富的鱼类之一 , 分布于中国、印度、美国及东南亚各国沿海的热带、亚热带暖水海域 。

石斑鱼的表型多样性还体现在体型大小、繁殖季节、产卵周期、产卵量等方面。石斑鱼为雌雄同体、雌性先熟鱼类 ,雌鱼达一定年龄及大小时发生性转化。从体型大小分 ,石斑鱼可分为大型和小型两种 : 小型的如赤点石斑鱼 ( E. akaara) 和青石斑鱼( E. awoara) 2～3龄体重达0. 3～0. 5 kg时 ,可发现性腺成熟的雌雄个体。大型的如巨石斑鱼 ( E.tauvina) 、云 纹 石 斑 鱼 ( E. moara) 、七 带 石 斑 鱼 ( E.septemf aciatus) 等 。巨石斑鱼的体重一般雌性 4. 8～15. 2kg ,雄性 5. 7～29. 5 kg。云纹石斑鱼及七带石斑鱼的体重则分别为 2. 5～30. 0 kg 和 2. 5～6. 5 kg。石斑鱼的繁殖季节一般从春夏之交开始 ,盛夏间结束。但也因地域、环境不同而有所不同。如赤点石斑鱼在中国浙江为 5～7 月 ,福建为 5 ～9 月 ,台湾为 3～5 月 ,香港为 4～7 月 ,海南为 3～8 月 ;青石斑鱼在浙江为 4～6 月 ,在海南为 3～7 月。石斑鱼产卵的周期可分为 2 种类型。一种类型是以赤点石斑鱼及巨石斑鱼为代表 ,于一年的某段时间内持续产卵 1～2 个月。另一种类型是以小齿石斑鱼(日本冲绳) 、条带石斑鱼 (小笠原群岛) 、棕斑石斑鱼(台湾、菲律宾) 为代表 ,以月龄为周期产卵 ,即于 5～8 月间 ,每个月的新月前后 3～4 d 内集中产卵。石斑鱼的产卵量因种类不同差异很大。大型的一季可产上千万粒卵 ,小型的只产几十万粒。如云纹石斑鱼 ,体长 95 cm的亲鱼 ,在一个繁殖季节可产卵 2710. 8 万。但同种石斑鱼会因亲鱼的来源、年龄、个体大小、饲育条件、营养状况不同 ,产卵量而不相同。如赤点石斑鱼每尾亲鱼的产卵量少则有 7. 6～93. 3 万粒 ,多则有 369. 8～556. 4 万粒。国内学者王涵生等还曾对赤点石斑捕捞群体的年龄组成以及生长发育作了初步研究。

2. 2 　染色体水平

染色体是遗传物质的载体 ,是基因的携带者。染色体的变异必然导致遗传变异的发生 ,是生物遗传多样性的重要来源。染色体变异主要表现在染色体组型特征的变异 ,包括染色体数目变异 (整倍体、非整倍体) 和染色体结构变异(缺失、易位、倒位、重复) 。另外 ,染色体水平上的多样性还表现在染色体的形态 (着丝点位置) 、缢痕和随体等核型特征上。

国内外从 20 世纪 60～70 年代开始进行鱼类染色体研究。先后有学者用压片法、胚胎细胞 —低渗 —空气干燥法、外周血淋巴细胞(或肾短期) 培养 - 低渗 - 空气干燥法、肾细胞 PHA 活体注射 - 空气干燥法(或火焰干燥法) 等多种方法用于鱼类染色体标本制备 ,使鱼类染色体的研究工作得到迅速发展 ,同时各种显带技术 C 带、Ag - NORs、Q 带、G带应用到鱼类染色体研究中 ,特别是荧光原位杂交技术(FISH)的应用 ,为鱼类染色体变异、种间杂交相关研究、Ag - NORs

多样性研究提供了很好的技术手段。随着染色体压片技术、染色体显带技术、原位杂交技术的应用与发展 ,在染色体水平上将揭示出更加丰富的遗传多样性 。

近二三十年来 ,国内外在石斑鱼的核型研究上作了不少工作。在国内 ,杨俊慧等[25 ]对广东湛江地区青石斑鱼染色 C 带带型和 Ag - NORs 进行分析研究 ;李锡强等对斑带石斑鱼与黑边石斑鱼、陈毅恒对鲑点石斑鱼和六带石斑鱼 ,丁少雄等[26 ]对斜带石斑鱼 ,王云新等斜带石斑鱼与赤点石斑鱼的染色体及其核型分别进行研究。国内还有云纹石斑鱼( E. moara) 的染色体研究报道 。在国外 ,De- Aguilar 对 E. guaza 的核型及着丝粒缢痕上的异染色体片段的分析[8 ] ;Sola 等[28 ]应用荧光染色技术、原位杂交技术等对 E. marginatus 进行核型、细胞标记等研究。目前的研究表明 :石斑鱼的染色体数目都为 48 ,在自然中没有多倍体现象 ,染色体形态多数是端部、亚端部着丝粒染色体 ,而中部、亚中部着丝粒染色体较少。许多学者认为 NF = 48～62 ,2n= 48t 是石斑鱼属染色体基本核型[22～28 ] 。但研究还缺乏种间及种内各地理种群的比较研究 ,更没有这些细胞遗传学研究与石斑鱼良种选育之间的内在联系。

2. 3 　蛋白质(酶) 水平

蛋白质(酶) 多态性研究主要是运用蛋白质电泳技术从基因的表达产物 ———蛋白质水平探讨遗传变异。鱼类的蛋白质遗传多样性的研究主要集中在同工酶、血清蛋白、血红蛋白、肌肉蛋白等 ,其中同工酶分析技术应用较为广泛 。

虽然同工酶电泳技术已被广泛应用于鱼类遗传多样性的研究 ,但关于石斑鱼遗传多样性的研究报道并不多。

研究过网纹石斑鱼乳酸脱氢酶同工酶。等运用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法对赤点石斑鱼 7组织的 4 种同工酶(EST、LDH、MDH、ME) 进行了初步研究 ,并 对 4 种酶的同工酶位点及酶谱表型进行了分析。结果表明 ,赤点石斑鱼的 4 种同工酶系统具有明显的组织特异性 ; EST由 4 个基因位点编码 ;LDH 酶带多于典型的 5 条酶带 ;MDH具有线粒体型(m - MDH) 和上清液型 (s - MDH) 两种类型 ;7种组织只检测到一种类型的 ME。丁少雄等[31 ]应用聚丙烯酰胺凝胶和淀粉凝胶技术对台湾海区斜带石斑鱼的遗传结构和遗传多样性水平进行了等位酶分析。共对 18 种酶系统27 个等位酶基因座位进行检测 ,表明 ADH - 1、ODH - 2、FDH- 2 和 Est - 3 等 5 个基因座位具多态性 ,其群体的多态位点百分率 P 为 18. 5 % ,有效等位基因平均数 Ne 为1. 185 ,平均杂合度的观测值 Ho 为 0. 0469 ,预期值 He 为0. 0662 ,反映了该群体的遗传多样性水平在鱼类中处于中等程度 ,而其Hardy - Weinberg遗传偏离指数(D) 为 - 0. 246 ,表明该群体仍存在着明显的杂合子缺失现象。Innocentiis 等利用等位酶技术对地中海 10 个地区的石斑鱼种群进行遗传结构的初步分析。

2. 4 　分子(DNA) 水平

DNA 是生物遗传的本质 ,遗传信息就是 DNA 的碱基排列顺序。因此 ,直接对 DNA 碱基序列的分析和比较是揭示遗传多样性最理想的方法。在 DNA 水平检测遗传多样性的方法有两种。一是直接测序 ,但由于鱼类的基因组过于庞大 ,直接测序显然很不实际。目前直接测序的主要集中在比较保守的 DNA 序列 ,如 rDNA ,Rubisco 大亚基基因等。另一种是基于 DNA 的特殊序列位点的分析技术。主要有常用的 RFLP 技术、基于 PCR 的各种检测方法和重复序列分析技术 ,如 RAPD、DAF、AFLP、微卫星 DNA 分析技术等。目前这些方法已经广泛用于鱼类的遗传多样性研究[4 ,5 ] 。

鱼类的 DNA 遗传多样性包括线粒体 DNA 遗传多样性和细胞核 DNA 遗传多样性。鱼类线粒体 DNA(mtDNA) 是一种大小约 17kb 的共价双链闭环分子 ,其编码着大约 22 个tRNA ,2 个 rRNA 和 13 个疏水性的蛋白质多肽 ;这些多肽包括细胞色素 b(Cytb) 、ATP 酶的亚单位、细胞色素 C 氧化酶的亚单位等。mtDNA 在研究鱼类的遗传变异、系统进化、遗传多样性等方面都有广泛的应用。美国学者 Gold 和 Richard2son 等(1994) 在对 E. morio 的 mtDNA 多样性水平的检测中发现 E. morio稚鱼及成鱼由于穴居习性 ,致使群体间基因流不畅 ,其 mtDNA 多样性水平是已报道过 mtDNA 检测的海水鱼中最低的。这至少说明了 E. morio 过去或最近发生过遗传上的瓶颈事件 。他们还应用 RFLP 技术分析 mtDNA ,以揭示种群结构特征。法国学者 Gilles 等对地中

海西部的 29 尾 E. marginatus 通过 PCR 技术对其 Cytb 核苷酸序列进行扩增 ,并结合所得数据进行分析 ,结果发现这种处于濒危的鱼种却具有丰富的遗传多样性 ,而且在地中海地区分布广泛。他们认为 ,这现象的存在不排除其他种石斑鱼基因渗透的可能性。

细胞核 DNA(nDNA) 是遗传物质的最主要的载体 ,是双亲遗传 ,能反映真正的进化历程。因此用 nDNA 来分析和比较是揭示生物遗传多样性最理想的材料。郑莲[40 ]对湛江沿海野生蜂巢石斑鱼 ( E. merra ) 进行 nDNA 的 RAPD 分析。

结果表明种群多态位点比例 (P) 为 65. 58 % ,平均个体间遗传相似系数 ( S) 为 0. 7887 ,平均个体间遗传距离 (D) 为0. 2113 ,遗传多样性指数 (H) 为 0. 1776 ,种群遗传多样性较高。印度学者 Govindaraju 等[39 ]用 4 个引物对印度东南岸和西南岸 7 种石斑鱼做了 RAPD 分析 ,并得到了所有种的特征性标记 ,为石斑鱼的分类与鉴别提供分子依据。研究还表明这 7 种石斑鱼的种内平均遗传距离(0. 305) 明显低于种间平均遗传距离 (0. 365) 。意大利学者 Innocentiis[32 ]等利用 7个微卫星、28 个等位酶对地中海 10 个地区的 E. marginatus种群进行遗传结构分析。结果表明这些地区间的石斑鱼有明显的遗传差异 ,说明这些地理种群之间不是随机交配的。

香港学者 Rhoes对利用微卫星技术分析了来自太平洋中西部 5 个群岛的石斑鱼种群 ,认为它们可分为 3 个不同的地理居群。Malia (2003)分离了夏威夷 E. quernus 种 群的 9个微卫星用于种群遗传分析 ,其中 6 个位点高度可变 ,等位基因位点数 6～18 个 ,杂合度 33. 3 %～91. 7 %。Zatcoff[38 ]等 对 E. morrio 的 4 个位点的微卫星检测来自美国东南岸和墨西哥湾的石斑鱼种群遗传结构 ,认为这些种群间现有或者过去有过基因流。欧美学者 ( Yvonne 等 ,1999 ; Wyanski 等 ,2000 ; Gold 等 ,1998 ;Richardson 等 ,1997) 分别对 E. striatus、E. itajara、E. morio 等石斑鱼开展了种质资源调查和部分分子遗传分析等方面的研究 ,但对于遗传多样性的研究都不全面 。

3 　结束语

石斑鱼是世界重要的海水经济鱼类 ,又是重要海水增养殖对象 ,其种类多 ,分布广。合理保护与开发石斑鱼资源具有不可估量的生态与经济地位。但就目前石斑鱼遗传多

样性的研究还十分有限 ,缺乏对石斑鱼的起源与进化、分类地位、不同的地理种群分化、养殖群体分化、种群结构等的系统研究。鉴于石斑鱼遗传多样性研究的重要理论与实践意义 ,结合国内外研究现状 ,对今后的工作提出以下几点建议。

3. 1 　应加强对各海域不同石斑鱼种群遗传结构、遗传分化、种间及种内群体间遗传结构的时空、动态分布、种群间的遗传关系等遗传多样性研究。了解石斑鱼遗传资源的特点 ,不仅为石斑鱼资源的保护与合理利用、管理法规的完善提供理论依据 ,而且可以丰富鱼类分类学、鱼类遗传学、生物保护学、遗传育种学等理论知识。

3. 2 　对养殖群体也应加强监控 ,了解其遗传背景、遗传分化及其发展动态 ,避免养殖群体种质资源的退化 ,制定科学合理的遗传育种计划 ,同时应加强养殖群体对野生群体遗传组成与结构的影响问题的研究。

3. 3 　构建石斑鱼种质资源基因库。构建种质资源是资源保护的重要举措之一 ,也是广泛开展分子生物学研究的重要条件。在构建石斑鱼种质基因库的基础上 ,积极开展石斑鱼分子标记、遗传进化、系统分类、基因定位、构建遗传图谱、分子辅助育种等工作 ,为种质标准的制定、种源区划、优良种源的选择以及长期合理利用石斑鱼资源奠定良好基础。

3. 4 　以培育生长快、抗逆性强的优良品种为目标 ,开展石斑鱼的育种工作。遗传育种的实质是利用其所具有的符合育种目标要求的基因。因此 ,基因资源是育种工作的物质基础 ,种群遗传结构和分化研究是理论基础。石斑鱼种类繁多、种质资源丰富 ,我们应充分开展石斑鱼遗传多样性研究 ,为选育或培育出生长快、肉质好、抗逆性强的石斑鱼品种打好基础。