【生化】Chem Sci：通过原位双吡啶构建固相荧光BODIPY-肽

固相肽合成（SPPS）是最常用的肽制备方法，以受保护的N端氨基酸作为构建基块并共价连接到不溶性树脂微珠上进行反复酰胺化和N-Fmoc脱保护后，以高产率制备肽片段。但是，荧光肽的合成则需要与荧光生色团结合，需要多步冗长且昂贵的纯化步骤。这种“荧光后标记”方法（Fig. 1A），需具有最佳的间隔距离和连接位点。幸运的是，“荧光构建块”作为一种荧光肽生产替代方法，成功地克服了上述限制（Fig. 1B）。因此，一系列基于有机荧光团的具有不同光物理性质和结构新颖的的荧光非天然氨基酸被开发出来。BODIPY-肽偶联物在生命科学领域常被用于双靶向成像工具，而BODIPY衍生物易受强酸影响，且通常不太适应SPPS条件，所以必须使用“荧光后标记”策略。

对于BODIPY前体而言，有两种常见的二吡啶衍生物合成方法：方法A，通过一种醛与两个吡咯之间的缩合，氧化得到对称的二吡啶衍生物；方法B，α-酮吡咯/α-甲酰基吡咯与另一种吡咯反应，得到不对称的双吡啶。这两种方法都会产生大量的杂质，如过量的吡咯、吡咯内交叉产物、氧化剂及其衍生物等，其与所需要的产物混合，使得纯化过程繁琐又费力。鉴于SPPS的优势，作者假设SPPS和双吡啶的合成可以很好地被结合（Fig. 1C）。

（来源：Chemical Science）

基于此，香港浸会大学的黄嘉良（Ka-Leung Wong）教授、德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所及德国神经退行性疾病中心（DZNE）的Markus Zweckstetter教授和Wai-Lun Chan教授课题组基于9-芴烯甲氧羰基（Fmoc）的SPPS在多肽的N端和侧链上原位构建二吡啶，并以靶向EBNA1的BODIPY₁-Pep₄进行模型研究。相关成果以“Solid-phase fluorescent BODIPY–peptide synthesis via in situ dipyrrinconstruction”为题发表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/D0SC04849F）。

首先，为了在树脂结合的Pep₁（H₂N-YFMVF-COOH）的N端上构建双吡啶，作者通过常规SPPS将苯甲醛部分连接在N端，然后在树脂上的BF₃·OEt₂催化下与2,4-二甲基吡啶发生缩合反应，随后添加2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌（DDQ）将新形成的二吡咯甲烷原位氧化为双吡啶。最终获得的二吡啶-肽共轭物DP₁-Pep₁的产率为51％，与未结合的肽（Pep₁，60％）的产率相当。相关反应产物通过HLPC，ESI-MS和¹H-NMR进行确证（Fig. 2）。

（来源：Chemical Science）

接下来，作者以各种醛和吡咯合成了一系列双吡啶-Pep₁结合物（Fig. 3）。其中，大多数反应物以较高的绝对和相对产率转化为相应的对称二吡啶结合物。DP₇和DP₁₁的失败表明，空间位阻可能会影响反应，而痕量的DP_8/17则说明了共轭乙烯基对条件的敏感性。对于不对称情况，作者采用了方法B：用POCl₃处理吡咯衍生物，以高收率获得了DP₁₅和DP₁₆。

（来源：ChemicalScience）

随后，作者探究了不同氨基酸组成的多种肽对上述方法的适用性（Fig. 4）。4-甲酸和2,4-二甲基吡咯被用来构建1,3,7,9-四甲基二吡啶（DP₁）的一系列多肽（包括所有的20种天然氨基酸和5种常用的非天然氨基酸）。全部多肽的产率与相应的未缀合肽产率相当。同时，合成的肽可用于多种研究。除N端共轭连接外，双吡啶部分还可以连接至Pep₁₁赖氨酸残基的侧链上，这表明作者的方法可以“通用且灵活地”应用于修饰侧链。

（来源：Chemical Science）

接下来，作者研究了SPPS硼的络合（图5A）。DP₁-Pep₁和BODIPY₁-Pep₁的¹H-NMR图谱如Fig. 5C所示。另外，作者制备了具有不同荧光颜色的BODIPY-缀合物（Fig. 5B），进一步说明了利用不同的BODIPY染料可以对新生肽进行快速荧光标记，从而用于生物成像和生物传感。

（来源：Chemical Science）

最后，为了验证合成的BODIPY-肽共轭物的实用性，作者在HeLa细胞系（EBNA1^-）和C666细胞系（EBNA1⁺）进行了BODIPY₁-Pep₄共聚焦成像实验，其中Pep₄为核渗透且靶向EBNA1的特异性肽（Fig. 6A）。与预期一样，BODIPY信号在表达EBNA1蛋白的C666细胞核中积累较快，而在HeLa细胞核内积累较慢。此外，BODIPY₁-Pep₄表现出近5倍的结合响应荧光增强（Fig. 6B），以及暗/光细胞毒性差异，这是由于BODIPY基团在光诱导下生成细胞毒性单线态氧（¹O₂）（Fig. 6C & 6D）。

（来源：Chemical Science）

总而言之，作者开发了一种高效便捷的方法，可在SPPS期间将肽与双吡啶部分偶联，然后进一步衍生为长波长发射且具有生物活性的BODIPY-肽偶联物，用于多色成像，为荧光肽的生产以及生物医学中的应用奠定良好的基础。