文末有《细胞外囊泡：基础研究与临床应用》书籍赠送！
细胞外囊泡领域的研究日新月异，在两年前细胞系水平的细胞外囊泡功能研究报道还时长在高水平杂志出现。但是，从2018年开始细胞外囊泡领域逐渐进入了一个相对成熟的阶段。虽然技术依旧不够完善，但是MISEV2018的发表使大家在这个领域中逐渐形成了一定的共识，细胞外囊泡相关研究向着更加精细化研究的方向推进。如何探索生物体在生理条件下产生的细胞外囊泡功能和作用就成为目前的一个研究热点。血液、淋巴液及脑脊液中细胞外囊泡成分来源相对复杂，如何分离特定组织中的细胞外囊泡就成为一个大家关心的话题。
《MISEV2018》中对组织外泌体的提取进行了简略的讨论，目前常见的组织来源细胞外囊泡的前处理策略分两种：1、将组织切薄片或剪碎后在体外培养一定的时间，然后从培养上清液中分离细胞外囊泡；2、经过消化或者灌注，从消化后的上清或灌注液中分离细胞外囊泡。研究者们普遍认为从组织提取细胞外囊泡最大的问题在于如何尽可能降低诸如胞内囊泡、凋亡小体以及人工处理中造成的人工囊泡等对细胞外囊泡样品的污染。此外，组织成分复杂，使用何种分离纯化策略也是一个需要着重考虑的注意事项（见《MISEV2018》原文11页）。
为了让从事相关研究工作的各位朋友更好更快的了解组织来源细胞外囊泡的分离策略，在这里分享几篇高质量论文中设计的组织细胞外囊泡分离策略。
Ref.1 Intra-Cardiac Release of Extracellular Vesicles Shapes Inflammation Following Myocardial Infarction. Circ Res 2018
文章的方法部分对心脏组织来源的细胞外囊泡的纯化进行了描述：先使用预冷的PBS灌注心脏，然后在预冷的生理盐水中将心脏组织剪碎（持续30反复剪切），之后将该生理盐水进行400g 15分钟的离心，上清进一步使用20500g 45分钟离心，获得的沉淀即为大细胞外囊泡；上清使用多聚物沉淀后，在使用10万g 90分钟沉淀，从而获得小细胞外囊泡。Ref 2. Small RNA fingerprinting of Alzheimer’s disease frontal cortex extracellular vesicles andtheir comparison with peripheral extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles 2020这篇文章主要使用了温和酶解法，将组织解离后提取细胞外囊泡：首先将脑组织剪碎，之后使用III型胶原酶对组织进行酶解处理。在37℃震荡水浴摇床上孵育20分钟，之后迅速进行冰敷并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。300g 5分钟离心，收集沉淀用于制作脑组织匀浆，上清用于细胞外囊泡分离。上清液首先经过2000g 10分钟离心去除细胞，再经过10000g 30分钟离心去除细胞碎片，之后将上清添加到蔗糖垫上，使用18万g离心3小时(SW41, Beckman Coulter)，收取含有细胞外囊泡成分的蔗糖垫。加PBS稀释后，10万g 离心1小时(70.1 Ti, Beckman Coulter)获得细胞外囊泡沉淀。Ref 3. Extracellular Vesicleand Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers. Cell 2020这篇文章是一个组学研究类型的报道。主要研究了不同肿瘤细胞、组织等来源的细胞外囊泡。在组织细胞外囊泡的分离策略上，该论文采用了组织切片培养法，培养上清先通过500g 10分钟去除细胞，3000g 20分钟去掉细胞碎片，12000g 20分钟去掉大囊泡。之后10万g70分钟离心(50.4Ti 或70TiBeckman Coulter)，得到细胞外囊泡沉淀并使用PBS清洗一次。一些特定癌症组织来源的细胞外囊泡再通过蔗糖垫来滤除特定的杂质成分。这三篇论文都发表在很好的杂志上，ref 1发表在心脏领域的顶级刊物上，ref 2发表在细胞外囊泡领域国际细胞外囊泡协会会刊上，ref 3发表在Cell杂志上。三篇文章都具有一定的代表性。参考这三篇文章可以确认，目前采用体外培养或者酶解法等解离策略都是被认可的。在后续细胞外囊泡的分离纯化过程中，三篇论文不约而同的都是用了超速离心作为分裂策略，2020年发表的两篇论文（ref 2，ref 3）则更进一步的使用了梯度密度离心（蔗糖垫等）进行细胞外囊泡的分离纯化。这对于从事组织细胞外囊泡研究的各位同仁具有一定的借鉴意义。今天的分享就到这里，希望对大家有所帮助。1. Hoshino, A., et al. Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers. Cell 182, 1044-1061 e1018 (2020).2. Loyer, X., et al. Intra-Cardiac Release of Extracellular Vesicles Shapes Inflammation Following Myocardial Infarction. Circulation research 123,100-106 (2018).3. Cheng, L., et al. Small RNA fingerprinting of Alzheimer's disease frontal cortex extracellular vesicles and their comparison with peripheral extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles 9(2020).
