科研 | Nature：保守的树突状细胞调控程序限制了抗肿瘤免疫
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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以往的研究显示：检查点阻断疗法已经改善了癌症治疗，但这种免疫治疗方案在一大部分患者中是无效的。传统的1型树突状细胞（DC1s）在临床前模型中控制对检查点阻断的反应，并与癌症患者更好的总体生存率相关，反映这些细胞启动CD8+T细胞反应的特殊能力。然而，矛盾的是，在抵抗检查点阻断的肿瘤中可以发现DC1s，表明这些细胞的功能可能在某些病变中发生改变。本研究通过对人类和小鼠非小细胞肺癌进行单细胞RNA-seq技术分析，研究者鉴定了一类树突状细胞（DCs），并称之为“富含免疫调节分子的成熟树突状细胞”（mregDCs），这是由于它们共同表达免疫调节基因（Cd274、Pdcd1lg2和Cd200）和成熟基因（Cd40、Ccr7和Il12b）。研究发现mregDC程序在肿瘤抗原摄取后由典型的DC1s和DC2s表达。进一步研究发现，mregDCs中一个关键的检查点分子--程序性死亡配体1蛋白的上调是由受体酪氨酸激酶AXL诱导的，而白细胞介素12（IL-12）的上调严格依赖于干扰素-γ，并受到IL-4信号的负调控。阻断IL-4能够增强携带mregDC1s的肿瘤抗原产生IL-12，扩大肿瘤浸润效应T细胞池，减轻肿瘤负担。总之，本研究发现了一个与肿瘤抗原摄取相关的调节模块，它降低了人类和小鼠癌症中DC1的功能。
论文ID
原名：A conserved dendritic-cell regulatory program limits antitumour immunity
译名：保守的树突状细胞调控程序限制了抗肿瘤免疫
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2020年4月
通讯作者：Miriam Merad
作者单位：西奈山伊坎医学院（美国 纽约）
主要内容
以前的研究发现，非小细胞肺癌（NSCLC）病变中DC1的数量较邻近肺组织减少，这提示研究者检测DC1缺乏是否影响表达癌基因KrasG12D和缺乏肿瘤抑制因子Tp53（也称为Trp53）的小鼠肺腺癌病变（KP病变）的生长。研究者使用了DC1缺陷型Batf3-/-小鼠，以及肺DC1缺陷模型（Irf8ΔDC小鼠），其中CD207+细胞（包括肺DC1s和Langerhans细胞）中DC1s发育所需的Irf8-a转录因子被删除，导致肺DC1s的特异性丢失（图1a）。与对照幼鼠相比，Batf3-/-和Irf8ΔDC小鼠表现出较高的肿瘤负荷，并减少了产生肿瘤坏死因子-α（TNF）和干扰素（IFN）γ的CD8+T细胞的数量（图1a）。如前所述，研究者还建立了一个扩大的肺DC1数的小鼠模型，通过从CD207+细胞中删除Pten。这些PtenΔDC小鼠有3倍的肺扩张和较低的肿瘤负担，与较高的TNF+IFNγ+CD8+T细胞数量相关（图1a）。
Fig1：富含免疫调节和成熟分子的树突状细胞簇的鉴定
尽管这些结果表明DC1的缺乏有助于为了降低抗肿瘤免疫，但研究者假设有其他的分子程序也可能降低体内DC1的功能。使用单细胞RNA测序（scRNA seq）技术，研究者分析了来自正常肺和含瘤肺的MHCII+CD11c+细胞谱系。无监督聚类分析显示三个簇表达典型的DC标记，如Flt3和Cd11c（图1b）。DC1基因包括Xcr1、Clec9a和Cadm1，而DC2基因包括Itgam、Cd209a和Sirpa（图1b）。第三个DC簇表达成熟标记分子，如Cd80、Cd86、Cd40，Relb和Cd83以及免疫调节因子，包括Cd274、Pdcd1lg2、Cd200、Fas、Socs1、Socs2和Aldh1a2（图1c）。该簇还上调与细胞骨架重排和细胞迁移相关的转录，显著下调Toll样受体信号相关基因的表达（图1c）。这种成熟标记和调控分子的模式使研究者将这个转录定义的簇解释为“富含免疫调节分子的成熟树突状细胞”（mregDCs）。
研究者在B16肿瘤的肺转移瘤，以及MC38肿瘤和MCA引起的肉瘤中CD45+细胞的公开的scRNA-seq分析数据中发现了相同的DC1s、DC2s和mregDCs簇。尤其是，mregDC信号与先前描述的在未成年小鼠跨不同淋巴结的迁移DCs细胞中的信号一致（图1d），相应地，肿瘤引流淋巴结（DLN）中的迁移树突状细胞也较丰富。这些研究结果表明mregDC模块的表达可作为调节外周抗原适应性反应的稳态机制。由于mregDCs缺乏由scRNA-seq技术检测到的DC1和DC2特异性标记，研究者随后通过对lin-MHCII+CD11c+DCs细胞的序列分析，对转录和表位进行了细胞索引，这将提供有关标记蛋白水平的信息。使用CITE-seq检测发现：DC1（XCR1+CD103+）和DC2（XCR1-CD103-CD11b+）细胞的子集都表达了mregDC信号，这提示DC1和DC2细胞均可分化为mregDCs（图1e、f）。此外，mregDCs表达DCs中最高水平的MHCⅡ类蛋白（图1e，g）。CITE-seq分析还揭示CD103+CD11b-mregDCs（mregDC1s）表达较高的Il12b、Ccl17、Irf8和Cadm1水平，而CD103-CD11b+mregDCs（mregDC2s）在其他基因中表达更高的Sirpa和Fcer1g水平（图1h）。由于转录本的无偏聚类没有识别出不同的mregDC1和mregDC2簇，研究者于是采用偏置方法检测mregDC簇内表达DC1或DC2标记基因的细胞。用大量的DC1和DC2基因对mregDCs进行分层，并与CITE-seq标记的表达进行比较，证明了CD103对CD11b阳性的mregDCs呈弱分层，而DC1和DC2被分成两个不同的群体，进一步证明这两个谱系的转录程序如何在分化为mregDCs的过程中大量聚集。
Fig2：mregDC1程序与肿瘤抗原的摄取有关
因为mregDC信号在DLNs中丰富，因此研究者在想是否通过向淋巴管的外渗来控制DCs中调节分子的生成。研究发现与野生型小鼠相比，Ccr7-/-小鼠的mregDC模块未受影响（图2a，b），这表明通过淋巴管的CCR7依赖性外渗不需要触发mregDC程序。
mregDC亚群在肿瘤病变中比在正常的肺中更丰富，导致研究者假设mregDC的诱导可能与凋亡细胞的负荷有关。为了检测DC1调节程序是否与肿瘤抗原摄取有关，研究者给小鼠注射了表达绿色荧光蛋白（KP-GFP）的KP细胞。结果发现：当DC1和DC2亚群在肿瘤组织中获得GFP时，GFP仅在DLN中的迁移DC1中可检测到（图2c）。这与之前的研究结果一致，与DC2相比，DC1降低了蛋白水解酶活性，这可能是它们增强交叉表达潜能的原因之一。相应地，GFP与肺DC1s中的胞质EEA1+室共定位，表明肿瘤抗原在DC1s的早期内体中被内化并保持完整（图2d）。KP-GFP荷瘤肺的GFP+DC1s和GFP-DC1s的RNA-seq检测显示，mregDC基因在GFP+室中富集（图2e）。此外，流式细胞术证实GFP+DC1s和DC2s上调了mregDC转录簇的许多蛋白产物，包括程序性死亡配体1（PD-L1）、CD40和IL-12（图2f）。同样地，在表达蓝色荧光蛋白（BFP）的DC1s中，mregDC基因模块的标记分子上调，这些DC1s在B16-BFP/OVA肺转移瘤中表达。使用骨髓来源的DC1，研究者测试了体外摄取紫外线照射的凋亡KP-GFP细胞是否与mregDC程序的上调相关。结果发现DC1s在体外捕获凋亡的KP-GFP肿瘤细胞时上调PD-L1、CD40和IL-12的表达（图2g），因此确定肿瘤细胞相关抗原的摄取与DC1中mregDC程序的诱导有关。
荷瘤抗原GFP+DC1s比GFP-DC1s更能促使原始T细胞分化为调节性T细胞（图2h）；然而，mregDCs也表达了许多免疫刺激分子。因此，研究者将KP-GFP肿瘤病变中的GFP+mregDC1s与GFP特异性T细胞抗原受体（TCR）共培养“JEDI”T细胞。研究发现GFP+mregDC1s在体外能激活CD8+JEDI T细胞（图2i），突出了DC1s诱导CD8+T细胞抗原特异性反应的能力和mregDCs的双重调节和免疫原性程序。
尽管诱导了许多调节分子，mregDC1s激活CD8+T细胞的能力促使研究者去研究调控程序的调节是否能进一步增强DC1s的免疫原性功能。值得注意的是，研究结果显示：虽然正常肺和含瘤肺中的mregDCs共享许多基因，但肿瘤相关mregDCs中Cd274和Pdcd1lg2的表达增加，而Il12b的表达减少，这表明肿瘤驱动的程序调节了DCs的功能。
Fig3：IL-4阻断增强DC1功能和抗肿瘤免疫
为了确定mregDC程序的驱动因素，研究者探讨了已知的调节PD-L1和IL-12表达的途径的作用。发现缺乏I型和II型干扰素信号并不抑制PD-L1在体内肿瘤抗原捕获时的上调 （图3a-c）。类似地，PD-L1上调仍然发生在缺乏炎症小体或TRIF/MyD88信号的情况下。相反，研究还发现IFNγ是DC1s中IL-12的主要驱动因子，由于缺乏Ifng或Ifngr1，DC1s在最开始或体内肿瘤抗原摄取时产生IL-12的作用被阻断，这与最近的结果一致（图3b、c）。然而，与先前的研究结果相反，Rag1–/–小鼠缺乏淋巴细胞并不能阻止DC1诱导产生IL-12，也不能阻止PD-L1和CD40在捕获肿瘤抗原时的上调。在GFP+DC1s中，IL-12的产生也不需要TLR信号。
吞噬细胞表面受体参与了骨髓细胞的免疫调节，这促使研究者探讨其对DC1抗原摄取的影响。利用scRNA-seq技术，研究者发现Axl是少数在mregDC1s中表达的吞噬细胞表面受体之一（图3d）。当GAS6和PROS1蛋白与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸结合时，可以诱导AXL活化。研究发现Axl缺乏减少了骨髓来源DC1中肿瘤抗原捕获时PD-L1的上调（图3e）。为了直接评估AXL在DC1s中驱动PD-L1表达的细胞内在能力，研究者用1/1比例的Axl+/+和Axl-/-骨髓细胞重建了致死性辐射小鼠。结果发现抗原摄取驱动的PD-L1上调在同一小鼠的肺Axl-/-DC1s中比Axl+/+DC1s中减少（图3f）。这些结果在体外用AXL激酶抑制剂R428证实，R428在捕获肿瘤抗原后减少了骨髓来源的DC1中PD-L1的上调（图3g）。这些结果与先前的研究一致，表明AXL调节肿瘤细胞中PD-L1的表达，并在抵抗免疫治疗的肿瘤病变中富集。然而，AXL抑制并没有通过DC1调节IL-12的产生（图3e，g），这促使研究者继续寻找IL-12产生的其他调节因子。
对mregDCs表达的细胞因子程序的分析显示，T-helper-2（TH2）应答基因上调，包括Il4i1（在静止的树突状细胞簇（FC）的27倍）、Ccl22（FC=29）、Tnfrsf4（FC=227）和Il4ra（FC=2.6）（图3h）。因此，荷瘤抗原的DC1s中IL-4Rα蛋白水平升高（图3i），提示研究者评估IL-4信号对DC1功能的影响。在荷瘤小鼠中使用IL-4阻断抗体，与用同型对照抗体治疗的小鼠相比，在不影响PD-L1水平的情况下，肺中产生IL-12的DC1的数量增加了一倍（图3j）。IL-4阻断后，DLNs中mregDC1s的IL-12水平升高更为强烈。重组IL-4直接作用于骨髓源性DC1去减少凋亡KP-GFP细胞捕获后IL-12的产生，这显示IL-4可以直接调节DC1功能（图3k）。总之，这些结果表明，阻断IL-4诱导的程序可以挽救IFNγ诱导的DC1s产生IL-12，而不调节PDL-1的表达。这与CD40激动剂（上调体内DC1的PD-L1的表达）和Toll样受体-3（TLR-3）激动剂poly（I:C）的作用形成对比，后者上调了PD-L1和CD40的水平，而不会增加体内DC1产生IL-12。
和同类型抗体处理小鼠GFP+mregDCs的比较，IL-4阻断抗体处理的小鼠GFP+mregDC1s更能激活JEDI CD8+T细胞（图3l）。同样，表达卵清蛋白特异性TCR（OT-II细胞）的CD4+T细胞，经IL-4阻断抗体处理的小鼠mregDCs激活，并经卵清蛋白肽脉冲处理，产生的细胞因子水平高于对照小鼠经卵清蛋白肽脉冲mregDCs激活的OT-II细胞（图3m）。值得注意的是，IL-4阻断抗体减少了抵抗PD-L1阻断的KP-GFP病变的发展（图3n，o），并且增加了肺癌（图3p）和DLNs中IFNγ+TNF+CD8+T细胞的数量。这些结果表明，体内mregDC产生过程中IL-4的阻断增强了mregDC的免疫原性和T细胞效应器功能。情况可能是这样的，IL-4阻断抗体诱导的抗肿瘤反应增强不仅是DC1功能增强的结果。
尽管如此，本研究的结果表明：（1） mregDC1表达IL-4Rα，并在肿瘤抗原摄取时上调IL-4诱导基因；（2） IL-4直接作用于dc1，调节其IL-12的产生；（3） IL-4阻断抗体存在时产生的mregDCs可导致T细胞活化增强；（4）IL-4阻断抗体增强DC1s产生IL-12，扩大体内IFNγ+CD8+T效应细胞的数量，这提示DC1s在IL-4阻断介导的抗肿瘤反应中起重要作用。
为了评估mregDCs是否存在于人体组织中，研究者用scRNA-seq技术分析了35例NSCLC患者的肿瘤和非受累肺组织中的免疫细胞。无监督聚类确定了表达CLEC9A、XCR1和IRF8的DC1簇和表达CD1C和FCER1A的DC2簇（图4a）。与在小鼠上得出的实验结果相似，研究者也鉴定了一个人类mregDC簇，它表达成熟标记CCR7、CD40、RELB和CD83以及调节分子CD274、CD200、FAS和ALDH1A2，以及低水平的TLR信号基因和高水平的迁移基因（图4a、b）。人类mregDCs也表达高水平的TH2反应基因IL4R、IL4I1、CCL17、CCL22和BCL2L1（图4c）。利用大量DC1和DC2基因对mregDCs进行直接分层，确定mregDC1和mregDC2亚群（图4d）。值得注意的是，这项分析证实，与小鼠一样，IL12B在人类中的表达是对mregDC1特异的（图4d）。
对7例NSCLC病变和非受累肺组织进行CITE-seq分析，证实DC1s和DC2s参与了mregDC簇的形成（图4e）。在所有的DC簇中，mregDCs表达最高水平的HLA-DR，PD-L1，PD-L2，CD86和CD40蛋白（图4e）。人DC1表达高水平的CD141和XCR1蛋白，而人类DC2表达高水平的CD1c（图4e）。此外，研究者还在一个公开的人非小细胞肺癌的病变scRNA-seq数据库中识别了mregDC。为了比对小鼠和人的DC亚群表达的基因特征，研究者根据每个物种中每个细胞类型的转录DC谱共同聚集基因和细胞类型，分析了小鼠和人类数据库中在树突状细胞中保守和可变的基因。分析表明，mregDC程序在两个物种之间是保守的（图4f）。
总之，研究结果揭示了DCs在不同组织、肿瘤类型和种类中表达的一个靶向免疫调节程序，它抑制DC免疫调节功能并控制T细胞激活的阈值。这种免疫调节程序与正常或过度细胞死亡过程中细胞相关抗原的捕获有关，并且富含携带抗原的DC，这些DC迁移到DLN以形成组织和肿瘤特异性免疫。此外，研究者发现这种免疫调节程序部分是由AXL和IL-4信号驱动的，IL-4阻断抗体可以拯救肿瘤病变中的DC1功能，增强细胞溶解性抗肿瘤免疫。这些结果扩展了先前的工作，表明IL-4/IL-13通路可以促进肿瘤生长，并强调需要试验在不同癌症类型中同时阻断PD-L1和IL-4信号的联合疗法。
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