科研 | Science Advances：金银花中的Rhodoxanthin合酶；膜二铁酶催化β-胡萝卜素与紫黄质的多步反应
编译：Nicole，编辑：十九、江舜尧。
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Rhodoxanthin是一种红色类胡萝卜素，广泛存在于植物以及某些鸟类和鱼类中。目前植物类胡萝卜素的生物途径及其相关酶系中核心部分的反应过程已得到了鉴定，但是反类胡萝卜素（retro-carotenoids）的酶和途径了解较少，rhodoxanthin属于非典型类胡萝卜素，其生物合成过程尚未得到解析。本文鉴定了一种β-胡萝卜素羟化酶（BCH）型整合膜二铁酶的变体LHRS（忍冬属羟化酶rhodoxanthin合酶）介导了β-胡萝卜素向rhodoxanthin的转化，并进一步确定了对紫黄质形成至关重要的LHRS残基。重要的是LHRS既可羟基化β-胡萝卜素，又可催化rhodoxanthin生物合成所需的独特的酮基化、去饱和和双键重排。本文除了解析rhodoxanthin的生物合成途径外，首次鉴定了得到LHRS为负责反类胡萝卜素合成的多功能酶。
论文ID
原名: Rhodoxanthin synthase from honeysuckle; a membrane diiron enzyme catalyzes the multistep conversation of β-carotene to rhodoxanthin
译名: 金银花中的Rhodoxanthin合酶；膜二铁酶催化β-胡萝卜素与紫黄质的多步反应
期刊: Science Advances
IF: 12.804（1区）
发表时间: 2020.4.22
通讯作者: John Royer
通讯作者单位: 美国帝斯曼营养产品公司
DOI号: 10.1126/sciadv.aay9226
实验设计
结果
红忍冬浆果中rhodoxanthin的鉴定
在以前的研究的基础上，通过高效液相色谱（HPLC）分离在同一位置生长的2个忍冬属植物（Bolton Red和Bolton Orange）的红色和橙色浆果的提取物，结果显示。红色浆果提取物包含主要rhodoxanthin，而橙色浆果中为β-隐黄质和玉米黄质。
从红色浆果中鉴定出高表达的BCH同源物
利用转录组和蛋白质组分析，在忍冬属植物（Lex Red）的成熟红色浆果和绿叶中均检测到与参与rhodoxanthin生物合成的相关基因。其中1个BCH样基因（BCHL）在红色浆果中高表达，而在叶组织中几乎未检测到。相反，另一种BCH基因（BCH）在两个组织中均表达。蛋白质组学显示红色和橙色浆果中许多类胡萝卜素生物合成酶的水平相似，而BCHL的表达在红色浆果中明显高于橙色浆果。
表1.红色（Bolton Red）和橙色（Bolton Orange）金银花浆果中类胡萝卜素生物合成酶的蛋白质组学分析。包含β-微管蛋白作为对照。BCHL随后更名为LHRS。
BCHL的序列分析
如图1C所示，金银花BCHL与之前报道的植物BCH酶同源，包含保守的组氨酸结构域和脂肪酸去饱和酶/羟化酶超家族的特征性跨膜结构域。但是，BCHL在已知BCH中高度保守的几个残基位置非保守。这些结果提示BCHL的催化活性可能与BCH的催化活性不同。系统发育分析证实，BCH与典型的植物BCH基因簇聚，而BCHL与共同祖先的分化较早。
本氏烟草瞬时表达BCHL的活性
为了测试BCHL在非rhodoxanthin生成植物中的作用，在BCHL的cDNA转染了本氏烟草，并将转染的叶片及对照叶片的提取物进行检测。结果显示转染BCHL促进rhodoxanthin的生物合成。
BCHL在大肠杆菌中的活性
为了确认BCHL在rhodoxanthin生物合成途径中的作用，利用开发的3个质粒的大肠杆菌表达系统，构建了具有泛番茄红素合成的Pantoea agglomerans Eho10基因和截短的忍冬属胡萝卜素环化酶LCY-B的大肠E. coli（MB8167）菌株。转化BCHL的单独质粒得到菌株MB8173。如图2和3A所示，在培养36小时后，MB8173积聚了胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质和rhodoxanthin异构体的混合物。HPLC检测发现包含3个rhodoxanthin异构体峰。基于其在植物和大肠杆菌表达系统中的rhodoxanthin生物合成的能力，将BCHL 重新命名为Lonicera羟化酶rhodoxanthin合酶（LHRS）。
图2. 表达细菌番茄红素生物合成基因、忍冬属LCYB和忍冬属BCHL的大肠杆菌提取物中类胡萝卜素的HPLC分离和PDA谱图。（A和C）大肠杆菌表达表达CrtE（香叶基香叶基二磷酸香叶酯合酶）、CrtI（并二苯并氢脱氢酶）、CrtB（并六烯合酶）、Idi（异戊烯基-二磷酸di-异构酶）和忍冬LCYB（番茄红素）。（B和D到F）表示表达CrtE、CrtB、CrtI、Idi、LCYB和忍冬属的LHRS的大肠杆菌。对应峰：1，胡萝卜素；2，β-隐黄质；3，紫黄质6Z，6′Z异构体；4，视紫黄质6Z，6′E异构体；5，红花黄素6E，6'E异构体；6，玉米黄质。BCHL后来更名为LHRS。
鉴定LHRS中rhodoxanthin生物合成的特异性关键残基
假设在LHRS中发现的相对于BCH酶内保守位置的特异性氨基酸残基是其rhodoxanthin合成活性的原因（图1C）。对23个LHRS的残基进行点突变，分别被等同的保守BCH残基取代。其中10个位置的单独突变导致了rhodoxanthin的降低，从而确定了这些残基有助于rhodoxanthin的生物合成。
番茄BCH向视黄质合成酶的转化
为了测试上述10个LHRS残基对rhodoxanthin合成的重要性，将所有10个LHRS残基替换为典型的玉米黄素生成BCH酶的相应位置的残基，创建CRTR-B2_10。天然CRTR-B2的表达导致β-隐黄质和玉米黄质的积累，而CRTR-B2_10还出现rhodoxanthin的积累（图3B）。
进一步分别评估10个残基的贡献，表明Thr72、Ile102和Pro103对rhodoxanthin的形成最有影响。将这3个残基单独或组合引入野生型BCH CRTR-B2，Phe替换Ile102的野生型CRTR-B2导致检测到rhodoxanthin。F102I与A72T或A103P或两者结合，可达到与CRTR-B2_10观察到的相似水平的rhodoxanthin积聚，证实了这3个位置在rhodoxanthin形成中起主要作用（图3B）。
图3. BCH基因及其突变体的表达对大肠杆菌中rhodoxanthin积累的影响以说明影响rhodoxanthin形成的关键残基。（A）空载体对照（pACYCDuet-1）和表达LHRS的大肠杆菌中的叶黄素积累；（B）S. lycopersicum BCH基因CRTR-B2，CRTR-B2_10（CRTR-B2 M28L、A29V、61T、A72T、F102I、A103P、G126D、M143I、F144L和Q173L）和CRTR-B2 A72T、F102I、A103P ; （C）P. agglomerans BCH基因（CrtZ）和CrtZ F52I、F53P。菌株MB8167表达crtE（香叶基香叶基二磷酸合酶）、crtI（六氢番茄红素脱氢酶）、crtB（六氢番茄红素合酶）、idi（异戊烯基二磷酸-异构酶）以及Lonicera的LCY-B（番茄红素-环化酶）。（D）嵌入膜中的LHRS模型结构，以绿色CPK表示了3个取代位点的位置控制rhodoxanthin形成。严格保守的催化His-金属簇以球和棒的形式显示。通往催化的His-金属簇的空腔显示为蓝色网格。
细菌CrtZ合成rhodoxanthin
为了检测3个残基的作用，进一步研究了与P. agglomerans（Erwinia herbicola Eho10）同源性更远的细菌BCH CrtZ，它与LHRS仅有36％的同源性，但缺乏 LHRS和植物BCH共有的跨膜结构域，22位的Thr相当于LHRS的T72。表达野生型酶在大肠杆菌MB8167菌株中导致rhodoxanthin积累（图3C）。F52I和A53P的点突变产生rhodoxanthin最大的积累。
LHRS的结构模型
基于酵母鞘脂羟化酶Scs7P的晶体结构模拟LHRS的结构模型（图3D）。在该模型中，先前确定的8个保守的组氨酸残基与脂肪酸γ-羟化酶的晶体结构中的等价位点重叠。该模型有一条很长的深通道，从酶的外部延伸到双金属活性位点，可容纳大多数β-胡萝卜素底物分子。有助于rhodoxanthin形成的102和103位关键残基位于一个螺旋的末端，而第3个关键残基72位于另一个螺旋的末端，与金属配位的His73相邻。
中间体的鉴定和β-胡萝卜素向rhodoxanthin合成途径的推测
在表达LHRS的大肠杆菌中rhodoxanthin形成的时间过程表明，胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质和rhodoxanthin的顺序积累（图4A）。进一步使用质谱（MS）分析了CrtZ_F52I、A53P的大肠杆菌培养物中类胡萝卜素的形成，显示了β-隐黄质、玉米黄质、3个未知物（Cmpds I、II和III）以及最后的rhodoxanthin的顺序积累（图4B）。
图4. 在表达LHRS和P. agglomerans CrtZ_ F52I, A53P的大肠杆菌中类胡萝卜素中间体和红球色素的形成。(A)在表达LHRS、CrtZ_F52I、A53P的大肠杆菌中类胡萝卜素积累的时间进程。(B)类胡萝卜素在CrtZ_F52I、A53P表达过程中积累的时间进程和PDA谱。
结合HPLC-MS、光谱特性和出现顺序（图4B），初步确定了化合物I，II和III，并提出了从β-胡萝卜素到rhodoxanthin的途径（图5）。初步确定了Cmpd I为β,β-胡萝卜素-3-ol,3'-酮，Cmpd II为β,β-胡萝卜素-3-ol,3'-二酮，Cmpd III为ε,β-胡萝卜素-3,3'-二酮。在将Cmpd III最终转化为rhodoxanthin时，通过引入一个额外的双键以及主链双键的异构化（图5）。
讨论
尽管已知植物中和鸟类存在rhodoxanthin和其他反类胡萝卜素，但它们的合成途径仍然是个谜。本文使用了转录组学和蛋白质组学相结合的方法来鉴定金银花BCH家族酶（LHRS），其表达与红色浆果中的rhodoxanthin形成有关。本文各种结果证明LHRS将β-胡萝卜素转化为rhodoxanthin，并提出了生物合成途径。
特别的是LHRS可以催化β-胡萝卜素羟基化以及β-胡萝卜素转化为rhodoxanthin所必需的酮化、去饱和和双键重排。而且LHRS的表达模式和特异序列与典型的忍冬属BCH相反，后者在叶片中表达更高。BCH酶是功能多样的二价铁酶的成员，可催化去饱和和羟基化反应。本文显示少量氨基酸取代会导致催化活性发生较大变化。3个氨基酸的取代使酶催化范围扩大，而不是发生了变化，导致了一种多功能酶，该酶保留了最初的羟化酶活性并获得了导致rhodoxanthin形成的多种活性。LHRS通过一系列不同的氧化步骤介导了从β-胡萝卜素到rhodoxanthin的多步反应，其中每个步骤的产物成为下一催化循环的底物。
LHRS的同源性建模证实它与脂肪酸β-羟化酶具有结构相似性。控制rhodoxanthin形成的3个关键残基位于假定的底物结合腔附近。该模型表明，这些关键残基可能通过改变典型BCH产物玉米黄质以及其他中间体的结合而发挥作用。
图5所示的rhodoxanthin的中间结构和途径。第一步是典型的BCH的反应，rhodoxanthin的生物合成中包含了独特的延长的氧化途径是通过将玉米黄质的羟基顺序转换为交替环上的酮基，然后进行异构化将一个环从β转变为ε，最终去饱和从而导致额外的双键，并且键从标准构型向逆构型转化，从而形成rhodoxanthin。从β-胡萝卜素到rhodoxanthin的转化几乎肯定需要释放中间体并重新结合以允许两个环的氧化。这种结合-释放-再结合循环可能导致游离中间体的积累。
有趣的是，与BCH相关的两种酶具有不同寻常的功能：LHRS和类胡萝卜素β环4-脱氢酶（在Adonis aestivalis的虾青素生物合成中具有活性）参与了红色色素的合成。据报道，红色花朵与鸟类授粉有关；因此，红色的水果和花朵可能会为依赖鸟的种子和花粉传播的植物赋予选择优势。目前正在开发的rhodoxanthin可以替代糖果、软饮料和化妆品中的人造红色染料和天然色素。
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