科研 | Cell：灵长类动物卵巢衰老的单细胞转录组图谱（国人佳作）
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
卵巢是卵母细胞的来源和类固醇性激素的主要供应者。因此，卵巢对于维持女性生育力和内分泌动态平衡都是必不可少的。卵巢是人类中表现出早期衰老相关功能障碍的器官之一，仅在30岁以后就会明显下降。与年龄相关的卵泡数量和卵母细胞质量下降导致女性生育力下降。更年期是卵巢生理衰老的自然结果。卵巢癌、2型糖尿病和乳腺癌等其他疾病也可能与卵巢衰老有关。因此，深入了解推动卵巢衰老的机制至关重要。卵巢是一个复杂的结构，由处于不同阶段的多种异质细胞类型组成，包括处于不同发育阶段的卵泡。每个卵泡由卵母细胞，周围的颗粒细胞和/或卵泡膜细胞组成。它们通常散布在整个卵巢皮质中，在成熟过程中移入延髓。对于诸如卵巢的异质器官，常规的批量RNA测序（RNA-seq）方法难以准确地揭示基因表达中细胞类型特异性的变化，特别是对于稀有细胞类型。随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展，现在有可能在单细胞水平上分析高度异质组织内基因转录的变化。值得注意的是，改良的单细胞标记逆转录（STRT）技术可实现单细胞RNA-seq的多重检测，并可检测每个细胞的丰富基因，尤其是对于较少的细胞而言。 由于伦理上的限制和无病的人类卵巢组织的获取途径的限制，由于非人类灵长类动物（NHP）与人类具有相似的遗传和生理特征，因此成为研究卵巢衰老和功能障碍的理想模型。此外，它们的卵巢形态特征，月经周期和性激素分泌模式与人类卵巢相似。重要的是，NHP卵巢的衰老特征也与人类相似。然而，迄今为止，scRNA-seq尚未用于系统表征NHP卵巢（包括卵母细胞和卵巢体细胞），并且也未深入分析衰老对灵长类中各种卵巢细胞类型的影响。在这项研究中，研究者使用食蟹猴调查了卵巢衰老的第一个综合性单细胞转录组学情况。
研究确定了七个卵巢细胞类型的基因表达特征，并通过scRNA-seq绘制了卵泡形成过程中四种卵母细胞亚型的独特转录景观。此外，衰老相关的基因表达变化表明，氧化损伤是卵巢衰老的重要因素。对人类颗粒细胞的分析显示，类似的衰老相关的抗氧化基因下调，而这些基因的敲低损害了氧化应激反应。这些数据表明，细胞类型特异性氧化还原调节网络的功能衰退对卵巢衰老具有深远的影响，为卵巢衰老的临床诊断提供了潜在的生物标志物，并为开发与衰老相关的卵巢疾病和女性不育症的新疗法提供了靶标。
论文ID
原名：Single-Cell Transcriptomic Atlas of Primate Ovarian Aging
译名：灵长类动物卵巢衰老的单细胞转录组图谱
期刊：Cell
发表时间：2020.2.6
影响因子：36.21
通讯作者：刘光慧
通讯作者单位：中国科学院动物研究所
DOI号：10.1016/j.cell.2020.01.009
结果
1. 食蟹猴衰老卵巢的卵泡储备减少
研究者从四只4-5岁和四只18-20岁食蟹猴中获得了卵巢（图S1A）。由于猕猴属的物种在大约25岁时经历更年期，此处分析的老年猴处于绝经前或绝经期。因此适合研究卵巢衰老。从组织学上讲，从幼龄猴子收集的卵巢在每个发育阶段（原始，初级，次级和肛门窦卵泡）的卵泡都少于从幼猴收集的卵巢（图1A）。值得注意的是，老年卵巢比年轻卵巢具有更高的闭锁卵泡百分比（图1B和S1B）。这些结果表明，与衰老相关的卵巢卵泡储备减少，以及衰老过程中原始卵泡池的加速损失。另外，在老年卵巢的基质中观察到卵巢纤维化增加（图1C）。
图S1. 与猴子有关的信息和单细胞RNA-Seq的质量控制
图1. 通过猴卵巢单细胞RNA-Seq分析确定具有转录特征的独特卵巢细胞亚群
要研究卵巢衰老过程中单细胞分辨率下基因表达的细胞类型特异性改变，研究者使用改良的STRT技术对食蟹猴的卵巢进行了scRNA-seq分析（图1D）。对于这些分析，研究者在酶消化之前将卵巢大致分为皮质和延髓（图1D）。经过严格的细胞过滤后，保留了从四个年轻和四个年龄较大的个体收集了2,601个单细胞（418个卵母细胞和2,183个体细胞）的高质量转录组，用于后续分析（图S1C）。为了表征卵巢细胞类型，进行了单细胞调节网络推断和聚类（SCENIC）分析，对每个单个细胞中的基因调节网络的活性进行评分，以鉴定稳定的细胞状态。首先建立具有与转录因子（TFs）共表达的基因的模块，然后应用顺式调控基序分析来选择显著富集的模块，以对子网的活动进行评分。然后根据从SCENIC分析获得的子网活动信息进行t分布随机邻居嵌入（t-SNE）维数分析，并通过无监督聚类分析揭示了7种主要细胞类型（图1E）。总体转录组谱分析显示不同年龄猴子之间卵巢细胞类型分布没有显著差异，表明这些细胞类型反映了细胞之间的生理差异，而不是技术差异或遗传背景的影响（图S1D）。SCENIC分析揭示了调节细胞类型特异性基因调控网络的几种重要转录调节因子，例如卵母细胞（OOs）的FIGLA，颗粒细胞（GC）的NR5A2和基质细胞（SC）的TCF21（图1F）。为了进一步识别这些细胞簇，我们在t-SNE图中绘制了定义明确的细胞类型特异性标记的基因表达图谱（图1G和S1E）。因此，鉴定出七个细胞簇，包括卵母细胞和六种类型的卵巢体细胞（图1E和1H）。 根据卵母细胞特异性标志物的表达，鉴定出与卵母细胞相对应的簇，例如SYCP3（减数分裂必不可少），DDX4和GDF9（卵母细胞发育必不可少）和ZP3（透明带的组成必不可少的）（图1G，2A和S1E）。通过免疫荧光成像证实了SYCP3和DDX4在这些细胞中的定位（图2B和S2A）。除了这些经典标记，我们还鉴定了一组卵母细胞的新型标记，包括主要在原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中表达的LMOD3（图2A和2B）以及主要表达的RBM46和NETO1（图2A和S2A）在卵泡形成不同阶段的卵母细胞中。
图S2. 通过免疫荧光验证不同卵巢细胞类型
图2.猴子卵母细胞的单细胞RNA表达调查
3. 卵母细胞的四个亚型在发育阶段的独特基因表达特征
图3.卵母细胞亚型在逐步发育阶段的动态基因表达模式
图S3. 卵母细胞亚型中的动态基因表达模式和转录特征
4. 老年卵母细胞中抗氧化基因的下调
接下来，研究者试图确定卵巢细胞中基因表达的衰老相关变化。 SCENIC分析揭示了年轻和老年卵巢中均匀分布的细胞群以及类似表达的细胞类型特异性标记基因，表明衰老对卵巢细胞身份的影响最小（图S1D和S4A）。此外，GenAge数据库中与衰老/寿命相关的基因以及包括早熟卵巢衰竭（POF）和原发性卵巢功能不全（POI）在内的卵巢疾病数据集都注释了热点基因主要在卵母细胞，GC和SC中表达（图S4B和S4C），表明这些细胞类型对卵巢稳态和衰老很重要。年龄相关变异系数（CV）的计算表明，原始卵泡的卵母细胞比晚期卵泡的卵母细胞表现出更高的转录噪声（图4A），这表明衰老引起了较高的变异性。早期卵泡的卵母细胞比晚期卵泡的卵母细胞好。进一步的分析表明，在旧的和年轻的卵母细胞亚型C1，C2，C3和C4中，分别有534、335、864和1,068个DEG上调，而106、286、346和278个DEG分别下调了（图4B）。值得注意的是，大多数与衰老相关的DEGs都是亚型特异性的，所有四种卵母细胞亚型只有14种上调和6种下调，表明衰老是卵母细胞特异性的。在每种卵母细胞亚型的发育特异性基因中仅观察到适度的表达变化，例如减数分裂相关基因（图S4D）。此外，基于基因集富集分析（GSEA）的GO分析揭示了每种卵母细胞亚型的细胞功能与衰老相关的变化（图4C和S4E）。特别是，在卵母细胞亚型C2中，“氧化磷酸化”和“氧化还原酶活性”途径中的几个基因被下调（图4C）。
接下来，在体细胞中检测了转录噪声并鉴定了与衰老相关的DEG（图5A和5B）。大多数与衰老相关的基因表达变化是体细胞类型特异性的（图5B）。GC对卵泡发育和体内平衡至关重要，因为它们通过物理相互作用为卵母细胞提供营养和机械支持。由于GC的凋亡通常会导致滤泡闭锁和卵巢衰老，因此我们着重研究了GC中基因表达与衰老相关的变化。年轻和老年GC之间的比较显示，随着年龄的增长，上调了62个基因，下调了72个基因（图5B）。 GO分析显示，上调的基因富含“凋亡过程的正向调节”，而下调的基因富含“氧化还原酶活性”（包括IDH1 [log2（倍数变化）= -0.83，p值= 7.8×10-5]，PRDX4 [log2（倍数变化）＝-0.59，p值＝ 0.002]和NDUFB10 [log2（倍数变化）＝-0.76，p值＝ 5.4×10-5]）（图5C和5D；表S4）。研究者还观察到老年人中DNA氧化（8-OHdG阳性细胞）和损伤（γH2AX阳性细胞）增加（图5E），以及凋亡增加（TUNEL阳性细胞）和增殖减少（Ki67阳性细胞）。猴子GC（图5E和5F）。 GC中的转录调节网络显示ELF4和FOSB是中枢基因，可调节基因的下调子集（图5G和S6A）。与年轻卵巢的GC相比，老年GC中这些抗氧化剂基因的蛋白质水平也降低了（图5H）。总之，这些发现表明，与还原酶活性有关的基因的下调可能导致衰老的GC中抗氧化反应受损。
6. 击倒人类颗粒细胞中的抗氧化基因概括了老年猴颗粒细胞的主要表型
为了确定这些抗氧化剂基因在衰老过程中在人GC（hGC）中是否也下调，研究者从21岁至46岁的健康女性那里获得了hGC（图6A和S6B）。首先，观察到来自健康供体的hGC中与衰老相关的活性氧（ROS）水平增加和凋亡，进一步支持了生理衰老过程中hGC的严重氧化损伤（图6B）。与猴子的结果一致，hGC表现出与衰老相关的IDH1，PRDX4和NDUFB10下调（图6C）。接下来，研究者探索了通过使用小分子干扰RNA（siRNA）沉默人类颗粒细胞（KGN细胞）中的这些抗氧化基因的效果，并通过RT-qPCR和Western blotting分别验证了敲低效率（图S6C和S6D）。击倒IDH1和NDUFB10会降低细胞增殖（图6D）。H2O2处理进一步减慢了IDH1，NDUFB10-或PRDX4敲低细胞的增殖（图6D）。此外，在氧化条件下kangj，敲低IDH1或NDUFB10导致线粒体质量增加（Mito-Mass）和线粒体去极化（图6E和6F），以及细胞ROS水平和细胞凋亡增加（图6G和6H）。全基因组RNA-seq分析（图6I和S6E–S6H）进一步揭示，IDH1或NDUFB10敲低分别上调118和156基因，下调405和381基因（图S6G）。GO分析表明，上调的基因在敲除IDH1后在“细胞死亡的调控”和“对刺激的反应”方面以及在NDUFB10的敲除后的“细胞衰老的正调控”方面均富集，而下调的基因均主要与氧化还原酶活性相关（图6I）。接下来，探究在卵巢衰老过程中，人类细胞中的这些转录变化是否与猴子GC中的转录变化相似。在存在H2O2处理的情况下，IDH1敲除的人颗粒细胞和成年猴的GC中都有5个基因上调，而7个基因则被下调，而NDUFB10敲除的人类颗粒细胞和GC共有6个上调和11个下调的基因。来自年迈的猴子（图S6I）。值得注意的是，一些通常被下调的基因，例如DCXR和TXNIP，参与了细胞氧化还原稳态（图S6I），这可能与老化的GC中氧化还原稳态的失衡有关。总而言之，这些结果表明IDH1和NDUFB10可以保护GC免受人类和猴子的衰老相关氧化应激（图6J），并且从猴子卵巢的scRNA-seq分析得出的结论与人类卵巢衰老有关。
结论
评论
卵巢衰老和女性与年龄相关的生育力下降的分子机制仍不清楚。研究者调查了年轻人和老年人的非人类灵长类动物（NHP）卵巢的单细胞转录组学情况，并鉴定了七种具有不同基因表达特征的卵巢细胞类型，包括卵母细胞和六种类型的卵巢体细胞。卵母细胞基因表达动力学的深入解剖揭示了在顺序和逐步发展阶段的四个亚型。细胞类型特异性衰老相关的转录变化的进一步分析揭示了早期卵母细胞和颗粒细胞特有的抗氧化剂信号传导的紊乱，表明氧化损伤是卵巢功能下降的关键因素。此外，在老年妇女的颗粒细胞中观察到灭活的抗氧化途径，活性氧增加和凋亡。这项研究以单细胞分辨率全面了解了灵长类动物卵巢衰老背后的细胞类型特异性机制，揭示了新的诊断性生物标记物以及与年龄相关的人类卵巢疾病的潜在治疗靶标。
更多推荐
1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响