科研 | 国人作品：转录组和生理学分析确定大黄鱼(Larimichthys Crocea)肝脏在急性缺氧时的关键代谢变化
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国东南沿海最重要的海洋经济鱼类之一。然而，低氧胁迫是大黄鱼产业良性发展的主要障碍。为了了解大黄鱼适应低氧的能量代谢机制，研究者分析了在不同持续时间的低氧胁迫下大黄鱼肝脏的转录组和生理学特征。实验共获得243756080个有效可用片段，其中83.38%的片段被成功地定位到大黄鱼的参考基因组。热图分析显示：在不同时间点，编码糖酵解/糖异生酶的基因显著上调。此外，编码柠檬酸循环、氧化磷酸化和氨基酸代谢相关酶的基因在6h和24h显著下调，但在48h和96 h上调。肝脏在呼吸代谢等生理过程中的变化，以及糖代谢酶的活性也呈现出相似的趋势。结果表明，低氧胁迫24 h，大黄鱼呼吸代谢主要为厌氧，24 h后有氧代谢占优势。糖代谢在能量供应中起着至关重要的作用，氨基酸代谢是应对急性低氧应激的重要支持物质。短期急性应激对脂质利用无明显影响。本研究使大家增加了对鱼类低氧应激中能量代谢机制的认识，为大黄鱼的遗传育种提供了有用的资源。
论文ID
原名：Transcriptome and physiology analysis identify key metabolic changesin the liver of the large yellow croaker (Larimichthys crocea) inresponse to acute hypoxia
译名：转录组和生理学分析确定大黄鱼(Larimichthys Crocea)肝脏在急性缺氧时的关键代谢变化
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.527
发表时间：2019年11月
通讯作者：竺俊全、沈伟良
作者单位：宁波大学海洋学院宁波市海洋与渔业研究院
结果
使用Illumina HiSeq 2500测序平台，从分析的五个样本中，共获得243756080个有效可用序列。有效碱基的数量约为36.44G，每个样品的平均有效数据量为7.29G。各样品序列中GC含量均大于48.14%，呈正态分布。超过96.16%的碱基准确度达到99%以上，有91.34%的碱基准确率为99.9%。对每个样品的有效序列进行测序，并与大黄鱼的参考基因组进行比较。比对有效率达83.38%以上，在参考基因组中具有唯一位置的有效数量达76.05%以上，表明测序结果良好，满足后续分析的要求。
为鉴定DEG，研究者分析了低氧胁迫（Li-6h，Li-24h，Li-48 h，Li-96h）和对照（Li-0h）对大黄鱼肝脏转录组的影响。采用错误发现率（FDR）<0.05和| log2（差异倍数）|>1的标准，共有5281个基因被鉴定为DEGs。与对照组相比，在6h时有762个基因上调，1594个基因下调（图1A）。在24h时，851个基因上调，1050个基因下调。在48h时，892个基因上调，735个基因下调。在96h时有1079个基因上调和788个基因下调。此外，在所有处理组中检测到54个上调基因和98个下调基因（图1B和C）。
Fig1：A: 低氧胁迫不同时间下差异表达的基因数目；B：Venn图显示上调基因中的唯一的和共有的DEGs；C：Venn图显示下调基因中的唯一的和共有的DEGs。
为了进一步探讨DEGs的表达模式，研究者使用STEM软件将DEGs分为四组。获得20个模块，其中模块1、0、16、19、15和12是显著富集的模块。此外，在模块1中，拥有最高数量的DEGs，24小时是一个显著的转折点。
为了对DEGs进行深入分析，研究者对以下处理组的DEGs进行GO富集分析：Li-6h与Li-0h，Li-24h与Li-0h，Li-48h与Li-0h，Li-96h与Li-0h。结果显示，在四种比较的显著富集的前五个是一致的，即RNA指导的DNA聚合酶活性、RNA依赖性DNA生物合成过程、肌原蛋白复合物和鸟苷酸环化酶活性，表明这些功能在低氧适应过程中具有重要意义。在分析剩余的显著富集类型后，发现Li-6h与Li-0h和Li-24h与Li-0h的DEGs主要富集在碳水化合物代谢活性（碳水化合物激酶活性、果糖-6-磷酸代谢过程、己糖激酶活性、葡萄糖结合和磷酸果糖激酶活性）和Li-48h和Li-0h主要与遗传信息的复制和转录（核小体组装、DNA整合、核小体、RNA转运和mRNA分解代谢过程的调控）有关。Li-96h与Li-0h的DEGs主要参与免疫和抗氧化系统（血管内皮生长因子信号转导通路、细胞氧化还原稳态、抗原处理和通过MHC I类的肽抗原的表达和氧化还原酶活性）。
与对照组相比，DEGs的KEGG途径富集分析表明，4条途径（糖酵解/糖异生、Toll样受体信号途径、丙酮酸代谢和碳代谢）在6h显著富集（图2A）。四条途径（果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生和胰岛素信号途径）在24h显著富集，只有两条途径（核糖体和类固醇生物合成）在24h显著缺失（图2B）。在48h，三羧酸（TCA）循环、糖酵解/糖异生、氧化磷酸化、碳代谢和内质网中的蛋白质加工显著富集（图2C）。在96h时，显著富集的途径是内质网蛋白质加工；精氨酸和脯氨酸代谢；氨基酸生物合成；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；碳代谢；生物素代谢；糖酵解/糖异生；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；组氨酸代谢（图2D）。
Fig2：在(A)6h vs 0h，(B)24h vs 0h，(C)48h vs 0h，(D)96h vs 0h的差异表达基因中KEGG途径显著富集的概况
据KEGG途径富集分析，研究者发现碳水化合物代谢相关的途径在不同的时间点显著富集。因此，研究者对125个与碳水化合物代谢途径（糖酵解/糖异生、氧化磷酸化和三羧酸循环）有关的基因进行了热图分析。热图分析数据显示，糖酵解途径中编码重要酶基因的表达，如HK、ALDOA、GAPDH、PFK和TPI在每个时间点都显著上调。与三羧酸循环和氧化磷酸化途径相关的编码基因的表达，如SDH、MdH、CS、FH和COX，在6和24h显著下调，然后在48和96h逐渐上调。
此外，氨基酸代谢相关途径在96h显著富集，因此，研究者还对氨基酸代谢相关基因进行了热图分析。结果显示大多数基因在6h和24h显著下调，并且在48h和96h显著上调。脂质代谢相关基因在低氧胁迫下不同时间点的表达无明显变化（图3）。
Fig3：低氧条件下参与大黄鱼肝脏代谢过程的DEGs的热图分析
图4显示了在低氧胁迫96h后，大黄鱼血清ATP、乳酸、葡萄糖水平和肝糖原水平的变化。低氧组ATP水平总体升高，显著高于常氧组（P＜0.01）（图4A）。低氧组乳酸水平在6 h内显著升高1.68倍（P＜0.01），其他时间点无明显差异（图4B）。低氧组血清葡萄糖水平先升高后降低。葡萄糖水平在6h时最高（增加3.08倍，P<0.01）然后逐渐下降，48小时和96小时分别下降1.09倍和1.26倍（P<0.01）（图4C）。低氧组肝糖原水平逐渐降低，显著低于常氧组（P＜0.01），48 h后趋于稳定（图4D）。
Fig4:大黄鱼对低氧胁迫的碳水化合物代谢反应
低氧组肝脏HK活性在48 h达到高峰（2.01倍，P＜0.01），此后下降（图4E）。PK和PFK活性也有类似的变化。低氧组在48 h时达到高峰（分别为2.50和2.61倍，P＜0.01），在96 h下降（图4F和G）。与常氧组相比，低氧组LDH活性在24 h达到高峰，然后在96小时显著下降（P＜0.05）（图4h）。低氧组SDH酶活性在24 h前显著下降（P＜0.05），与常氧组相比差异显著（P＜0.05）（图4I）。在24、48和96小时，低氧组的G-6-磷酸酶活性与常氧组相比无显著性差异，但在6 h时显著升高（P＜0.05）（图4J）。低氧组PEPCK活性与应激时LDH活性相似，并呈先升高后降低的趋势，活性最高出现在24小时（增加1.43倍，P<0.01）（图4K）。与常氧对照组相比，GP活性在48 h时最高（1.62倍，P＜0.01），然后逐渐降低（图4L）。GS活性与GP活性相反，低氧组的活性明显低于常氧组，在48h时活性最低（1.6倍，P<0.01），随后逐渐增加（见补充文件7）。
Fig5：在不同低氧时间下大黄鱼蛋白质代谢的变化
如图5所示，与常氧组相比，缺氧组6 h和24 h TP和TAA水平无明显变化，24 h后开始下降，96 h达到最低水平（P＜0.01）（图5A和B）。ALT、AST和GDH活性在6h时也无明显变化，但随后持续升高，并在48h（AST、GDH）或96h（ALT）时达到最高（图5C、D和E）。脂质代谢相关指标没有明显的生理生化变化，包括甘油三酯、CHOL、ACC和HSL水平（见补充文件8）。
采用实时定量PCR技术进行数据验证
为了验证转录组数据的可靠性，采用荧光实时定量方法，根据其表达水平计算了14个DEGs的转录水平。相关性分析表明，两种分析结果之间存在极显著的线性相关关系（R2=0.88163），这表明转录组数据是高度可靠的（图5F）。
讨论
随着高通量测序技术的发展，转录组技术已成为研究水生动物应对低氧胁迫的重要工具，并已成功应用于斑马鱼、青鳉、武昌鱼、尼罗罗非鱼、黄鳝等的研究。本研究对低氧条件下大黄鱼的mRNA表达和代谢产物的动态变化进行了研究，以了解其低氧适应的机制。据研究者所知，这是有研究首次分析了低氧胁迫下大黄鱼肝脏转录组测序数据，为深入研究大黄鱼的基因资源提供了有价值的资料。本研究共获得含有36.44G的测序数据的2.43亿次有效序列。通过KEGG分析得到的糖酵解/糖异生，丙酮酸代谢，碳代谢，TCA循环，氧化磷酸化，丙氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸代谢均与代谢有关。能量代谢的调节可能是大黄鱼对低氧应激反应的有效策略。
当水生动物暴露于低氧胁迫时，呼吸代谢首先受到影响。此时，除了进行有氧代谢外，组织还进行厌氧代谢，琥珀酸脱氢酶是嵌入线粒体膜内的有氧代谢的唯一酶，催化琥珀酸氧化形成富马酸盐并释放ATP。它是有氧呼吸的限速酶，其活性能反映有氧代谢水平。乳酸脱氢酶是一种重要的代谢调节酶，催化丙酮酸在厌氧代谢中生成乳酸，其活性在一定程度上反映了厌氧代谢水平。低氧应激0～24 h，低氧组LDH活性高于常氧组，低氧24～96 h LDH活性低于常氧组。而SDH活性则呈现相反的趋势。有趣的是，编码在三羧酸循环和氧化磷酸化（或有氧代谢）中所涉及的酶的基因（如SDH、MdH、CS和FH）在低氧应激后24h上调，编码糖酵解相关（或无氧代谢）酶的基因，如HK、ALDOA、GAPDH和PFK，在24小时前显著上调，之后降低（图3）。这些结果表明在低氧胁迫24 h内，有氧代谢受到抑制，厌氧代谢增强，24 h后有氧代谢在一定程度上得到恢复和增强，厌氧代谢减弱。厌氧代谢能迅速提供能量和减少氧气消耗，无氧代谢能量供应是对低氧适应的一个自然选择过程，尤其是在急性低氧应激的早期阶段。在本研究中，24小时后观察到的变化可能是由于厌氧代谢过程中能量的增加小于有氧代谢的预期减少。因此，有氧代谢的增加和无氧代谢的抑制可能在一定程度上增加能量供应。据报道，厚鳍图丽鱼在低氧（0.7mg/L, 5h）时抑制有氧代谢，糖酵解酶活性降低，并随着LDH活性的增加和耗氧量的降低而增加其无氧代谢。鲍鱼在功能性缺氧（18分钟）中主要利用厌氧代谢。然而，转录组数据表明，冠海豹面对缺氧挑战（95% N2+5%CO2，60min）时有氧代谢相对增加，而厌氧代谢没有显著变化。此外，在高原低氧胁迫（7天）后，大鼠肝脏有氧氧化增强，未发生厌氧氧化。这些实验结果表明，在一个时间点上获得的结果难以反映实际的动态变化，应激和缺氧应激水平的持续时间也是影响呼吸代谢的重要因素。因此，在不同的低氧胁迫条件下，动态观察呼吸代谢是未来研究的方向。
乳酸是厌氧呼吸的重要产物之一。据报道，低氧胁迫导致南美白对虾血淋巴乳酸水平显著升高，约为对照组的四倍。Li等人发现急性缺氧条件下尼罗罗非鱼血液中乳酸水平显著升高，但肝脏无明显变化。同样，在本研究中，研究者发现，肝脏的乳酸水平在急性缺氧应激胁迫的6小时显著增加，这表明通过肌肉和红细胞中的厌氧代谢产生的高水平的乳酸通过血液循环进入肝脏。但如果乳酸长期积累，不能尽快恢复供氧，糖酵解过程将被完全抑制，不再形成ATP，危及生命。有趣的是，在本研究中，研究者发现一元羧酸转运体（MCT2，MCT4）的表达在不同时间点也显著上调。一元羧酸转运体家族成员，它们是细胞膜上重要的跨膜转运蛋白，负责乳酸和短链脂肪酸等一元羧酸的跨膜转运。MCT2对乳酸和丙酮酸具有高度亲和力，主要以乳酸为有氧代谢或糖异生底物的在组织中表达。MCT4通常存在于高度依赖糖酵解的细胞中，并负责乳酸的流出。因此，MCT2和MCT4的快速上调导致大量的乳酸从肝细胞中排出，使乳酸水平恢复到正常水平，从而确保肝脏内的代谢平衡。这些发现与Hoff等人对冠海豹的研究结果相似。此外，Chen等人还发现低氧处理能显著使原代培养的大鼠海马星形胶质细胞中MCT4的表达上调。因此，研究者猜想MCT2和MCT4的表达上调可能是生物体缺氧的适应机制之一。
从KEGG途径富集分析，研究发现，糖代谢途径（包括果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生和碳代谢）与碳水化合物（糖）代谢有关。因此，糖代谢对大黄鱼适应低氧具有重要意义。肝脏是糖代谢的主要器官，也是维持血糖平衡的主要器官。维持血糖水平的恒定主要取决于四个糖代谢过程的平衡，即糖生成、糖原分解、糖酵解和糖异生。尼罗罗非鱼短期缺氧应激可导致糖原和血糖水平降低。研究发现，在低氧胁迫8 h后，肝脏糖原含量显著降低，与本研究的结果相似，即低氧胁迫96 h后，糖原水平升高，糖原代谢的关键酶活性也增加，包括糖原磷酸化酶和糖原合成酶也在肝脏中受到影响。在低氧应激条件下，增强机体的抗氧化能力和抑制细胞的生长，可保证机体各种组织的基本能量需求，同时维持血糖水平的恒定。
然而，储存在肝脏中的葡萄糖或糖原的利用是有限的，大多数生物体也需要通过糖异生来合成葡萄糖，以维持机体正常的能量需求。在这种情况下，乳酸、丙酮酸、丙酸和甘油等一系列非糖化合物在G-6-Pase和PEPCK等酶的催化下转化为葡萄糖或糖原。在本研究中，糖酵解的关键酶如HK、PK和PFK，以及糖异生相关酶如PEPCK和G-6-Pase在6、24、48和96h显著上调。虽然糖酵解和糖异生之间有些酶（如TPI、ALDOA和PGAM）是共有的，但其他酶对分解代谢或合成代谢的反应（如糖酵解中的HK和糖异生中的G-6-Pase）是特异的。
低氧对大黄鱼氨基酸代谢的影响
人们对蛋白质作为鱼类组织功能能量的使用知之甚少。缺乏这些信息源于蛋白质作为哺乳动物能量来源的作用微不足道，但水生动物的情况可能有所不同。低氧应激可能对蛋白质代谢有一定的影响。有研究表明在裸背鳗属在低氧胁迫3小时后，游离氨基酸水平显著降低。基于cDNA微阵列分析，Gracey等人揭示了参与长颌姬鰕虎鱼蛋白质翻译和氨基酸代谢的基因显著上调。此外，对史氏鲟的研究表明，低氧胁迫显著增加氨基酸代谢相关基因CYP1A的表达。同样，在本研究中，研究者发现参与氨基酸代谢的基因在48h和96h时显著上调，总蛋白和总氨基酸水平在48h和96h时也显著降低。与必需氨基酸合成和蛋白质代谢有关的三种关键酶AST、ALT和GDH的活性在24h后显著升高。总体而言，低氧胁迫下24小时后，大黄鱼氨基酸分解代谢过程被认为是重要的补充途径。
Butier等人的研究显示，无论硬骨鱼是否迁徙，在能量供应不足时蛋白质都会优先或最终转化为碳水化合物。来自红鲑鱼的研究的证据还表明，当所有其他底物耗尽时，蛋白质在低氧胁迫的最后阶段将成为主要的能量供给。在低氧胁迫下，大黄鱼肝脏组织中的一些糖原氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸）被分解代谢。碳骨架通过分解代谢可转化为丙酮酸、α-酮戊二酸、琥珀酰辅酶A、富马酸、草酰乙酸等代谢产物。这些代谢物可以进入TCA循环产生ATP供能或者通过糖异生途径产生葡萄糖，然后循环进入其他组织促进糖酵解。糖异生途径的显著增强证实了这一结论。肝脏中氨基酸分解代谢和糖异生途径的结合可能是在低氧应激下维持血糖水平的一种适应性机制，并为机体提供持续的能量供给，这点和长颌姬鰕虎鱼上的研究发现类似。然而，某些氨基酸的具体作用还需要进一步研究以了解缺氧胁迫下水生动物的氨基酸动态。
此外，结合呼吸代谢和碳水化合物代谢的变化，研究者发现24h是大黄鱼代谢转化的关键点。DEGs的聚类分析还表明，在模块1（DEGs数量最多的显著富集模块）中，24h是一个临界点。这些结果表明，24h可能是大黄鱼低氧适应的一个重要时间点。类似的结果出现在山樱花Cerasus sachalinensis的缺氧研究中，发现6 h是低氧适应的重要转折点。
除了碳水化合物和蛋白质外，脂质也是向机体提供能量的储能物质，TG是重要的能量来源之一。脂质是维持组织功能最关键的物质，因为它们每克产生的能量比其他任何物质都多。在本研究中，大黄鱼肝脏中的甘油三酯和CHOL水平以及ACC和LPL活性没有显著变化。虽然类固醇生物合成途径在24小时显著富集，但并不影响生理生化指标。研究者推测急性低氧应激可能持续很短的时间，因此不影响脂质代谢。然而，在低氧胁迫下鱼类对脂质的使用是有争议的。一些研究表明，脂肪分解活性在低氧应激中降低，而另一些研究则显示出相反的结果。结果的不同可能与低氧应激的种类和持续时间的差异有关，需要进一步的研究来证实这一结果。
讨论
本研究的结果显示，在急性缺氧胁迫24 h内，大黄鱼呼吸代谢主要参与厌氧代谢，24 h后有氧代谢占优势。大黄鱼在低氧应激时，通过促进糖元分解、糖酵解和糖异生，抑制糖原生成，在一定程度上稳定了能量供应。此外，24h可能是大黄鱼低氧适应的一个重要转折点。总之，在应对急性低氧应激时，碳水化合物代谢在能量供应中发挥重要作用，且氨基酸代谢是一个重要的补充（图6）。此外，短期应激对脂质利用没有显著影响。这些结果将有助于阐明水生动物在急性缺氧条件下的能量代谢机制。
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