科研 | NAT PLANTS：多重组学揭示荒漠藻类对极端光照的完全抵抗机制
编译：依然，编辑：景行、江舜尧。
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小球藻在两倍阳光照射下突出的表现，显示出科学家对其光合机制如何运作以及是什么设定了其功能上限的理解上的差距。光系统II的独特功能不是在极端光照下屈从于光损伤，而是能使小球藻保持较高的光合作用和生长速度，并伴随着组成和细胞结构的重大变化。这种卓越的性能使作者能够研究活跃代谢细胞中光合作用和生长对于极端光照的系统反应。利用氧化还原蛋白质组学、转录组学、代谢组学和脂质组学，作者探索了促进过剩氧化还原能量耗散、蛋白质S-谷胱甘肽基化、无机碳浓度、脂质和淀粉积累以及类囊体堆积的细胞机制。小球藻具有利用过剩的还原力和碳进行生长和储备的能力，而翻译后氧化还原调节在这种快速反应中起着关键作用。小球藻的这种偏离模式物种的响应策略，反映了它在沙漠中的生活史。全球和具体个例的比较分析为理解小球藻对极端辐射的极端抵抗力中的潜在进化作用提供了理论依据。
论文ID
原名：Multi-omics reveals mechanisms of total resistance to extreme illumination of a desert alga
译名：多重组学揭示荒漠藻类对极端光照的完全抵抗机制
期刊：Nature Plants
IF：13.256
发表时间：2020年7月
通讯作者：Haim Treves
通讯作者单位：德国马克斯·普朗克植物分子生理研究所
DOI号：10.1038/s41477-020-0729-9
实验设计
结果
在100µ mol photons m−2s−1微光（LL）以0.08h-1速率连续生长的藻细胞在8h至18h时，其表现出明显的生长抑制(图1a)。连续极端辐照水平（EIL）条件下的细胞生长速度(~0.12h−1)明显快于LL条件下的细胞生长速度。大约20h后，它们转换到一个较低的速率(~0.01h−1)，但仍高于在连续LL下的此时(图1a)。当细胞在LL下培养18.5h后转移到EIL时，生长在5min内增加到0.12h−1(图1b)，类似于连续EIL下的8-20h。在连续LL(~0.015 h−1)培养中，这种高速率维持了约1 h，然后下降到比这个时间点更快的速率(~0.008 h−1)。在接下来的24小时内，生长只有轻微的下降，到那时，培养物的总生物量达到了与连续EIL相似的总生物量(图1a)。
图1.转移到EIL的小球藻细胞的生长和细胞蛋白水平。a，小球藻细胞在温度35°C、充满空气（100mlmin−1）和100µ mol photons m−2s−1 的生物反应器中TAP培养基培养，18.5h后转移到3,000µ mol photons m−2s−1(时间点0，虚线)。b，放大的曲线图来自a.LL，t120EIL和continuous(Cont。) 用黑色箭头指定EIL时间点，用虚线箭头指定t3EIL和t15EIL。生长速率表示每个生长期的线性斜率，LL和EIL的初始斜率在8-18h之间。3个生物学上独立的重复得到了类似的结果。c, 用Bradford法测定总蛋白水平，并按不同处理的细胞计数进行划分(见方法)。数据为均值±标准差。(n=3个生物独立实验)。
2 光合作用和呼吸作用
从LL转移到EIL后，生物反应器中的氧气水平在开始3分钟内上升，图2反映了净放氧量的增加；之后在3到6分钟内下降到略低于原始水平(图2B)。这种下降的部分原因可能是EIL激活了C.ohadii中PSII循环电子流，导致呼吸速度加快(15分钟内翻了一番，图2c)。
在暴露于EIL后的3至6分钟内，pH升高了约0.2(图2b)。这可能反映了Ci的下降是由于二氧化碳净消耗加快，这一下降可能是导致氧气净释放在3到6分钟之间减慢的原因之一。
样品在进入EIL之前(LL细胞)和从生物反应器转移到封闭的氧气小室中15、30、60和120分钟后，在饱和光(4,000μphotons m−2s−1)下监测加或不加2 mM NaHCO3 情况下2分钟的净光合作用 (图2d)。在没有补充剂的情况下，转移到EIL细胞后的光合作用速率与LL细胞相等或略低于LL细胞。NaHCO3的加入不影响LL细胞的光合放氧速率，但提高了约60%(EIL细胞的光合放氧速率图2d)。
与已往报道一致，作者发现转移到EIL 120min后对HCO3− 和CO2（Ci）的亲和力大大增加(图2e，f)。有趣的是，在EIL下持续生长的细胞中没有观察到对Ci的高亲和力；这些细胞的最大光合作用速率高出20%，但Ci的表观K1/2也高出两到三倍(图2e)， EIL和连续EIL处理120min后Ci与光合作用关系的初始斜率相似，高于LL处理(P=6.372×10−13和1.983×10−19；图2f)。这表明在持续的EIL作用下，CCM在中高Ci范围内受到损害。
图2.暴露于EIL的小球藻细胞的光合作用和呼吸作用的变化。a-f，C.ohadii细胞在生物反应器中培养，温度35°C，环境空气鼓泡，100μphotons m−2s−1，然后在时间点0(18.5h后，虚线)转移到3,000μ photonsm−2 s−1。b，在OD735 nm处测定细胞密度，在光生物反应器中用克拉克型电极测量转移到EIL过程中的氧气和pH水平。C，在35°C下用克拉克型电极测量呼吸速率，d，在饱和光强(4,000μ photons m−2 s−1)下，在加入2 mM NaHCO3和不加入2 mM NaHCO3的情况采样时间的选择。
采样时间的选择是考虑到(1)小球藻细胞周期仅为几小时(2)C.Ohadii可以在几分钟内完全适应非生物刺激，包括光和C的可用性(3)响应时间可能在不同的细胞功能水平上有所不同。作者分析了转移到EIL前、后15分钟和120分钟的基因表达谱(RNA测序(RNA-seq))(分别为LL、t15EIL和t120EIL)。作者分析了转移前和转移后120min(分别为LL和t120EIL)的极性代谢物(GC-MS/MS)和脂类(LC-MS/MS)。作者还分析了蛋白质组在转移前(LL)和转移后不久(3min)(分别为LL和T3EIL)的氧化还原反应。为了提供一个稳定的参考点，在该参考点中，单元被完全调节到极高的照度，即在EIL上生长18.5h后取样(连续EIL)。
3 短期和长期的转录组、代谢组和脂质体响应
作者总共量化了11047个核编码的转录本，108个叶绿体编码的转录本和37个线粒体编码的转录本，101个极性代谢物和147种脂类。由PCA图和采样策略捕捉到了转移到EIL后的瞬时变化，转录本的变化比代谢物或脂质的变化更快。
富集分析结果中与 GO库 “双链DNA结合”和“RNA依赖的DNA聚合酶活性”相关的条目显著过度表达，表明暴露于EIL后和持续EIL下都存在DNA损伤。其他转录本包括调节拟南芥对波动光的适应的KEA3的同源物，可以在光氧化胁迫下获得更高的存活率的CEST的同源物，以及一个编码Rubredoxin的基因显示了PSII的积累和几个有氧光营养物质的稳定性有关。这些观察表明，EIL促进了小球藻热激反应的翻译后氧化还原快速响应。
4 高动态响应的氧化还原蛋白质组
作者比较了每个处理中树脂结合封闭的硫醇和对照样本，并计算了与LL相比时的氧化还原指数(RI)变化。结果总共鉴定到了1061个蛋白质，其中181个(~16%的富含硫醇的蛋白质组)在t3EIL和或持续EIL时表现出显著的RI变化。小球藻响应的氧化还原反应蛋白中有11个丝氨酸苏氨酸激酶、3个预测转录因子、3个RNA相互作用蛋白和2个含四肽重复结构域的蛋白。其功能富集分析显示在磷酸转移酶/激酶活性相关蛋白、翻译、氧化/还原和脂质代谢等功能 (扩展数据图3A)。
小球藻响应的氧化还原反应蛋白中有23个蛋白含有假定的分泌信号肽(补充表2)。这其中包括四种丝氨酸苏氨酸激酶、两种硫氧还蛋白、多胺氧化酶和几种与细胞壁和多糖修饰有关的酶。它们分泌的蛋白可能在清除/运输过程、细胞壁组成的调整以及与沙漠盐壳中其他生物的相互作用中发挥作用。此外，作者发现在小球藻氧化还原反应蛋白中有若干蛋白的半胱氨酸含量异常高。
5 转录组预测压力反应和C分配模式
在t15EIL和t120EIL以及连续的EIL下，与LL相比进行GO偏倚分析(Fisher's Exact test)。在所有时间点，上调基因在 “谷胱甘肽分解代谢过程”、“肽分解代谢过程”和“硫化物分解代谢过程”中的表达最为强烈(扩展数据图4)。这表明谷胱甘肽作为氧化还原缓冲液在保护柯哈迪蛋白半胱氨酸免受不可逆氧化中具有重要作用。与DNA损伤和修复相关的基因也被过度表达(扩展数据图4a-c)。连续EIL下编码氧化还原反应谷氧还蛋白基因表达增加(补充表2) (补充表3)，连续EIL下谷胱甘肽S-转移酶RI也发生了改变(补充表2)。
6 呼吸和应激代谢物的广泛变化
t120EIL和持续EIL与LL状态下的代谢产物比较有82个显著变化代谢物。这82种代谢物的等级聚类定义了五个主要的簇。结果被可视化在热图上(扩展数据图5)，以突出初级代谢物的动态响应。图3显示了C.ohadii在t120EIL和连续EIL下，与LL相比的响应的路径图。
大多数代谢产物在t120EIL和持续EIL下表现出相反的反应。在t120EIL时，a和b簇中的代谢物含量较高，而在连续EIL下代谢物含量较低。这些簇包括葡萄糖和蔗糖等糖，许多呼吸中间体(磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、柠檬酸、苹果酸)，几种主要氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸)，甘油和甘油-3P。
7 CCM(二氧化碳浓缩机制)的功能
正如已经提到的，小球藻转移到EIL导致外部Ci迅速下降(图2A，b)，并在120分钟内显著降低Ci的K1/2表观 (图2a，b)，这说明它诱导出高效的CCM。与LL相比，在t120EIL时，乙醇酸水平较低，而在连续EIL时，乙醇酸水平较高(图3和扩展数据图5)。在甘氨酸水平相互变化的同时，丝氨酸水平以类似于乙醇酸的方式变化(图3和扩展数据图5和6)，这表明在持续的EIL下光呼吸增加。
这可以解释为什么在持续EIL下2 -氧戊二酸盐和谷氨酰胺水平较高，而谷氨酸水平略有下降(图3和扩展数据图5和6)。与LL相比(扩展数据图7)，在所有在t15EIL光呼吸途径增加的转录本在t120EIL时减少，在连续EIL状态时下调。这表明低Ci(见图2B)在转移到EIL的15分钟内诱导了光呼吸过程，但在120分钟效应又减弱了，这可能是因为建立了有效的CCM，并且当CCM不能有效地工作时，光呼吸是在持续的EIL下诱导的。
图3. 小球藻响应EIL的代谢组。t120EIL(a)和连续EIL(b)代谢物显著变化(n=3个生物独立实验，单因素方差分析，P<0.05)。显著较高(红色)或较低(蓝色)水平的代谢物被突出显示。用黑色显示的代谢物没有显著变化，用灰色显示的代谢物也没有被测量。
8 转录本、代谢物和脂质反应的相互作用
为了能够更系统地整合转录组、极性代谢物和脂质数据集，作者使用方差分析对LL、t120EIL和连续的EIL的数据集进行了线性模型拟合。如图4A所示，样本之间的分离与模型所解释的拟合方差的百分比有关，且在不同功能水平之间是可比较的。平均而言，极性代谢物、脂肪和转录物的变异分别有78%、70%和43%可由处理解释。转录本、极性代谢物和脂质数据在LL和t120EIL下表现出类似的反应。极性代谢物的连续EIL反应较强，表现出最大的处理间距离。
图4B描述了与模型相适应的变量的系数。此外作者还展示了富集的差异转录组。在t120EIL中，与分解代谢、细胞氧化还原动态平衡、ATP合成、呼吸和有丝分裂相关的转录本上调。蔗糖和几种三氯乙酸循环中间体，以及PC36：6也在t120EIL时增加。持续的EIL导致萜类生物合成、DNA修复、维生素B6生物合成和核苷代谢上调，并导致乙醇酸、2-OG、AsA、几种部分不饱和的半乳糖脂和TAG的积累。DGDG C36：6(叶绿体膜的主要脂类之一)、麦芽糖和甘露糖在两种EIL处理下均有上调。在LL和t120EIL条件下，甘油、甘油磷酸酯和肌醇磷酸水平较连续EIL升高。
9 蛋白质氧化还原修饰在EIL下提供了一个不依赖于基因表达的调节层
为研究受转录调控的一组基因和响应EIL翻译后氧化还原调控的一组基因之间是否存在重叠，作者比较了在t15EIL或连续EIL下显示转录丰度显著高于LL的基因组，以及在t3EIL或连续EIL下其蛋白质在氧化还原调节方面与LL相比发生显著变化的基因组。出乎意料的是，这两个功能级别之间的基因重叠非常有限(图4C)。
图4. 极性代谢物、脂质和转录本反应与普通光环境的整合。a, 将转录本、极性代谢物和脂质数据集的L1、t120EIL和连续EIL分开的线性回归模型中样本的投影。b，模型的缩放系数适用于所有三个数据集。虽然分析使用的是整个数据集，但绘制的变量只包括那些在方差分析中对光照条件有显著反应的变量，调整后的P≤为0.05(n=3个生物独立实验)。对于成绩单数据，显示了丰富的差异成绩单的功能GO组。c，Venn图表示在t15EIL和连续EIL(转录组)下上调的基因和在t3EIL和连续(续)下的氧化还原反应蛋白之间的重叠。
讨论
研究者采用系统的方法来研究光合细胞如何应对极端的光照挑战。这是由于最近从沙漠生物沙壳的恶劣环境中发现并分离出一种耐高辐射的绿藻而实现的。研究者生成了一个多层数据集，其中包含细胞核、叶绿体和线粒体编码的转录本、代谢物和脂质，以及暴露于EIL后不同时间蛋白质的氧化还原反应。该组学分析与生长、光合作用和呼吸、NADPH水平、总蛋白和细胞形态的测量相结合。图5提供了EIL对小球藻代谢和细胞形态影响的多层次表征。
图5. 小球藻光合作用和C中心代谢对EIL处理时间响应的多组学图。这些基因、蛋白质、代谢物和脂质分别表现出较高(红色)和较低(蓝色)的表达水平、氧化还原反应和积累水平。根据讨论中提出的模型，箭头说明潜在的正(红色)和负(蓝色)、直接(实线)和间接(虚线)影响。
1 小球藻是一种高度耐光的光合作用生物
小球藻是一种高度耐光的光合作用生物，从LL转移到EIL后18.5h，光合作用和生长率在最初几分钟内就增加了15倍，然后在40-50分钟后下降到仍然比LL快两倍的速度(图1A)。这一下降并非由于在EIL下培养一段时间后变得光照受限，它可能反映了小球藻的多向生长模式，在LL下(图1A，培养物切换回17.5h开始的缓慢生长阶段，它仍然保持了比LL下更高的生长速率。作者在这里重点研究了光合作用和新陈代谢对EIL的响应。
在EIL作用下的3分钟内，快速的翻译后氧化还原反应影响了许多蛋白激酶/磷酸酶，这些蛋白激酶/磷酸酶本身可能为翻译后水平的调控提供进一步快速放大的可能性。翻译后快速氧化还原调节也影响参与氧化还原信号、HS反应、脂质生物合成和翻译的蛋白质(扩展数据图3A)。这种快速的翻译后反应可能是小球藻光合作用和生长对EIL快速反应的关键。有趣的是，它影响了的是一组不同的基因，而不是那些后来显示出转录丰度变化的基因(图4C)。
2 氧化还原反应蛋白质组促进过量NADPH的消耗和转移
即使在远高于饱和依赖二氧化碳的氧气释放所需的光照水平下，小球藻的光合作用没有表现出明显的光损伤效应。早前一些开创性工作研究了波动光对藻类和植物光合作用机制的不同方面的影响。作者的实验设计和小球藻的光谱特性(补充图4a，b)使作者能够研究对光子通量突然增加30倍的响应。
小球藻中在EIL下表现出调节氧化还原的相关蛋白质，包括先前证明的受到氧化还原调节的蛋白质的同源物以及许多新的氧化还原敏感蛋白质。这些蛋白质与过量的ROS和细胞NADPH的利用有关，例如增强呼吸(图2C，补充表2和补充文本)、生长(图2A)和脂质积累(补充文本)。
3 半胱氨酸含量的升高及S-谷胱甘肽的保护作用
小球藻基因组编码总半胱氨酸的蛋白质含量很高，这让人想起生活在高温下的细菌和古菌中，高半胱氨酸含量被认为有助于通过二硫键稳定蛋白质。这可能对暴露在沙漠地壳极端高温下的小球藻起到类似的作用。暴露在蛋白质中的半胱氨酸残基的出现代表了感知细胞氧化还原的能力和不可逆转的氧化损伤风险之间的权衡。综上所述，高度稳定的PSII2和高效的氧化还原利用都是小球藻对抗EIL的基础。
4 CCM的操作和对光呼吸的影响
移植到EIL后的小球藻C固定率迅速增加(图3)。在持续的EIL下，CCM的运作受到了损害。在t120EIL和连续EIL下，光合作用与外部Ci关系的初始斜率相似。光呼吸相关基因在t120EIL处被抑制，在连续EIL下被诱导间接证明了在t120EIL处内源Ci较高，而在连续EIL下内源Ci较低。此外，乙醇酸和其他光呼吸中间体在t120EIL时较低，在持续EIL下较高。 (图3和补充文本-有机和氨基酸代谢)。
5 脂质代谢、能量储存和类囊体重塑。
如上所述，小球藻表现出极不寻常的类囊体形态反应，它在EIL中堆积增加而不是像通常在强光下那样减少。除了TAG及其相关氧化还原反应的积累外，EIL还导致类囊体脂的重塑，为EIL下小球藻中类囊体堆积的增加提供了机制解释。这包括与LL相比，DGDG含量增加, DGDG含量的增加既是翻译后氧化还原调节的结果，也是关键基因诱导的结果。进一步的因素可能包括甘油-3P支架从类囊体膜蛋白到TAG的再动员，以及与蛋白质和脂肪往返类囊体膜运输相关的基因的变化(详情见补充文本-类囊体膜重构)。
结论
小球藻在弱光下保持过剩的代谢和生长能力，能够促进光合作用和生长对极高光照水平的即时反应。翻译后氧化还原调节在促进NADPH穿梭、NADPH利用、HS反应和脂质合成等方面做出了重要贡献。它还影响大量的调节蛋白，包括蛋白激酶/磷酸酶，为在翻译后水平上快速放大信号提供了巨大的潜力。15min后转录水平开始发生变化，包括诱导CCM和光合作用的，随后是淀粉和脂肪的生物合成，紧接着是代谢物水平的短暂变化，表现在脂质和淀粉逐渐积累。随着时间的推移，淀粉含量的增加可能会干扰CCM的正常功能。
总体而言，在几乎没有观察到滞后的情况下，小球藻可以通过增加的光子通量来生长和积累碳储量。尽管在维持高新陈代谢和生长能力方面投入了高昂的成本，但由此产生的灵活性可能对于其在独特的沙漠结壳环境中生存至关重要。作者之前的工作集中在小球藻 PSII的稳健性上，此项研究则揭示了其在EIL下存活的代谢灵活性。作者的数据表明在强大的PSII进化之前，代谢能力的广泛动态调节先于PSII，但这一观点仍然需要对藻类(特别是小球藻)进化生物学的深入研究来证实。
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