科研 |MOL METAB：链脲佐菌素模型中胰腺β细胞异质性的单细胞转录组学分析（国人佳作）
编译：小北，编辑：景行、江舜尧。
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目的：链脲佐菌素(STZ)模型广泛应用于糖尿病研究。然而对这个模型中胰腺内分泌细胞和分子状态尚不清楚。本研究对胰岛细胞经STZ处理后的分子特征及STZ模型中β细胞异常功能和再生重新进行了评估。
论文ID
原名：Characterizing pancreatic b-cell heterogeneity in the streptozotocin model by single-cell transcriptomic analysis
译名：链脲佐菌素模型中胰腺β细胞异质性的单细胞转录组学分析
期刊：Molecular Metabolism
IF：6.448
发表时间：2020年4月
通讯作者：徐成冉
通讯作者单位：清华大学生命科学中心生命科学学院
DOI号：10.1016/j.molmet.2020.100982
实验设计
结果
为了探究STZ处理小鼠的胰腺内分泌细胞的转录状态，研究者通过FACS对STZ处理小鼠进行了细胞分离并且通过修正的STRT-seq(mSTRT-seq)进行scRNA-seq。研究者利用Ngn3-Cre； Rosa-RFP小鼠对RFP+胰腺内分泌细胞进行富集（图1A-D），对小鼠进行单次高剂量(200 mg/kg) STZ处理并且对第6天到第9个月小鼠进行了评估（图1A）。在STZ处理第一天，研究者观察到胰岛素结构受损，并且一些INS+细胞消失。在第三天和第六天，被处理小鼠的体重显著降低，并且表现出严重的高血糖症，与对照组相比胰岛素的浓度也显著降低，这些结果说明在STZ模型中β细胞严重受损。在本研究中，只用在STZ处理后第2天有高血糖的小鼠进行后续实验。为了防止小鼠死于极端高血糖，并且在更长的一段时间内探究细胞的状态，研究者在STZ处理第2天皮下植入了一个胰岛素胶囊。研究者每隔三天在4 p.m检测了非空腹状态下的血糖，并且当检测到高血糖(>400 mg/dL)时植入胰岛素微丸。在胰岛素植入后血糖浓度低于400 mg/dL，但是没有植入的小鼠仍然是高血糖(>600 mg/dL)并且随后死亡。但是有两只并没有接受胰岛素供应的小鼠，在STZ处理后两个月仍然存活（图1A）。在STZ处理后在D12， M5以及M9时，研究者收集了胰腺组织以检测胰岛的形态，结果发现在受损的胰岛中β细胞很少。
总而言之，有2400个Ngn3-Cre； Rosa-RFP+ mSTRT-seq的样本通过质控。平均而言，在每个单细胞中确定了9×104UMIs以及4，500个基因。利用UMAP以及Louvain细胞聚类算法的t-SNE，研究者基于细胞标记基因的表达将细胞划分为7类：β细胞(Ins1+和Ins2+)、α细胞(Gcg+)、δ细胞(Sst+)、PP-cells (Ppy+)、导管细胞(Spp1+)、腺泡细胞(Cel+)以及免疫细胞(Ptprc+)（图1B-D）。Ngn3也在一部分多潜能胰腺祖细胞以及主干细胞中表达，也能够产生外泌体。这些非分泌的细胞可以从STZ处理的胰腺单细胞悬液中分选出来。因此，研究者从Ngn3-Cre；Rosa-RFP小鼠中获得了许多非内分泌的细胞。值得注意的是，研究者在每个STZ处理并带有胰岛素供应的动物中收集了至少150个细胞进行scRNA-seq。由于一系列时间点的细胞在UMAP和t-SNE中都聚类，并且在转录水平未发现突变体（图1B-C），研究者总结STZ处理后的细胞状态在一段时间是稳定的，不同时间点个体间转录图谱的变化可以中忽略。
图1. 细胞类型鉴定图。（A）本研究中利用scRNA-seq分析了2400个Ngn3-Cre; Rosa-RFP细胞，细胞#体积显示了特定处理条件下细胞的数量。D（M）：STZ处理后的天数（月份），在STZ处理第二天皮下注射胰岛素，N：没有胰岛素植入，*:在M7-M9没有胰岛素植入；
（B-C）UMAP和t-SNE点图说明不同亚型以及处理条件下细胞的分布，每个点代表一个单细胞样本，细胞数量在括号中表示，圈出的数字表示(A)中标记的细胞来源；（D）每个细胞类型中标记基因的表达水平。点的颜色由蓝色变化为红色，代表表达水平由低到高，点的大小代表对应细胞类型中标记基因检测到的比例。
2 STZ模型中β细胞的异质性
接下来研究者主要分析了β细胞。PCA和UMAP发现存在三种β细胞群体（图2A-B）。群体1包含的细胞来自非STZ处理的小鼠，群体2包含的细胞来自STZ处理和非STZ处理小鼠，群体3特异的包含STZ处理小鼠的细胞（图2C）。在这三种β细胞群体中研究者确定了451个差异表达的基因，包括23个转录因子（TFs）。集簇a的基因在群体2/3细胞中下调，包含一些维持β细胞命运非常重要的关键TFs，例如Nkx6.1， Pdx1， and Vdr，以及与β细胞功能相关的基因，例如Glut2 (Slc2a2)， Ucn3，以及Ins1（图2F）。GO富集分析证实集簇a的基因在与β细胞功能相关的条目中富集（图2E）。集簇b的基因在群体2/3中表达上调，并且在负调控应答外部刺激的条目中富集（图2E）。GO分析也证实在群体3的β细胞中果糖代谢上调（图2E）。一些基因例如Fbp1， Fbp2， 以及Pdk1已经有报道称参与果糖代谢，从而导致胰岛素分泌减少。研究者的scRNA-seq分析发现这些基因在群体3的β细胞中上调，提示群体3的β细胞处于功能失调的状态，分泌胰岛素以调节葡萄糖稳态。Etv1和Rorc是胰岛素分泌的负调节因子，包含在集簇b/c中，与群体2/3中Ins1的低表达一致（图2F），提示在群体2/3中的细胞有微弱的胰岛素分泌。研究者利用RT-qPCR选择性的验证了Ins1-RFP转基因小鼠分选得到的STZ处理的β细胞中Glut2， Ucn3， Ins1， Nkx6.1， Pdx1，以及Vdr的下调，以及Etv1， Klf10， Tspan8的表达上调（图2F）。通过免疫荧光染色证实STZ处理小鼠中NKX6.1的表达降低（图2G）。
为了分析群体2/3的β细胞是否能够恢复到功能群体1的β细胞，研究者沿着群体1到群体3的轨迹依据位置对细胞进行排列（图2H）。研究者发现群体1的β细胞在STZ处理后迅速消失，而群体3的β细胞一段时间后出现（图2H）。然而，只有少量群体1的细胞在不依赖于胰岛素外植体存在的STZ胰腺中被检测到（图2H）。这一发现证实在STZ处理一段很长的时间内群体2的β细胞转化为群体3的β细胞，但是不能恢复到群体1的β细胞。总之，研究者分析发现正常的和STZ处理的β细胞的异质性。在STZ处理的动物中，群体1的β细胞能够被选择性的杀死，而群体2的β细胞能够逃逸STZ介导的细胞死亡，但是基因表达发生了相应的改变并且转入了一种病理的状态，例如群体3的β细胞。
有报道称，一小部分β细胞坐落于胰岛的边缘而且不表达Glut2以及Ucn3。研究者重新分析了Ucn3-(Glut2low)以及Ucn3+ (Glut2high) β细胞的转录图谱。结果发现在群体1中229个高表达的基因以及在群体2中163个高表达的基因在Ucn3- (Glut2low)以及Ucn3+ (Glut2high) β细胞中普遍高表达（图2D）。因此，基于基因表达图谱的整体相似性，研究者猜想群体2中的β细胞包含由Van der Meulen等人鉴定的“原始的”β细胞。
图2.β细胞的异质性。（A-B）β细胞PCA和UMAP点图，每个点代表一个单细胞样本，颜色表示群组（左侧）、处理条件（中间）以及细胞来源（右侧），圈出的数字表示(A)中标记的细胞来源；（C）条形图说明对照组和STZ处理组小鼠三个细胞群的比例；（D）热图说明三个群体中差异基因的表达图谱，每一列代表一个单细胞样本，每一行代表一个基因，每一基因集簇中基因数量在热图的左侧标注，每个基因集簇中包含的转录因子（TFs）标注在热图的右侧；（E）三个集簇中GO富集条目；（F）PCA点图（上部）和小提琴图（中间）说明差异表达基因的表达水平。每个小提琴点图中的黑线表示表达水平的中位值，指定基因的表达水平通过整体细胞RT-qPCR以及β-tubulin的表达证实（底部），* p-value < 0.05; ** p-value < 0.01; *** p-value < 0.001；（G）对照组（上部）和STZ处理D1（底部）胰腺组织冷冻切片上胰岛素和NKX6.1的免疫荧光染色，箭头表示STZ胰腺中NKX6.1low β细胞，标尺为20 mm；（H）小提琴图说明每个群体和细胞来源伪时序值，圈出的数字表示(A)中标记的细胞来源，每个小提琴图内的黑线表示伪时序的中位值。
3 成年小鼠Glut2low的β细胞表现出不同于未成熟β细胞的状态
在成年小鼠中Glut2low的β细胞被认为是未成熟的β细胞，因为它们低表达成熟的标记基因Ucn3（图2F）。为了评估这些Glut2low的β细胞的成熟状态，研究者在产后3天P3、P12、P21小鼠的Ngn3-Cre；Rosa-RFP+细胞中进行了mSTRT-seq。将这些数据与成年Ngn3-Cre； Rosa-RFP+的数据库联合，研究者进行了PCA、UMAP以及FDL分析（图3A-C）。在PCA图上，大部分β细胞沿着从P3到成年Glut2high的路径排列，反映了β细胞的成熟过程（图3A）。奇怪的是，研究者从P3、P12以及P21小鼠中观察到很少Glut2low的细胞（图3A），但是在P12和P21，而不是P3，Glut2low的细胞可以在发育轨迹上从Glut2high的细胞中分离出来（图3A）。通过免疫染色，研究者在各个发育阶段胰岛的周围观察到GLUT2low的β细胞（图3D）。GLUT2low 的β细胞的分布图谱与Van der Meulen的发现一致，并且进一步提示通过scRNA-seq在健康小鼠中鉴定的GLUT2low的β细胞是“原始的”β细胞。这些结果清楚的说明在β细胞成熟过程中Glut2low的细胞发育。然而，STZ处理的成年β细胞（群体2/3的细胞）并不坐落在成熟轨迹上（图3A）。UMAP和FDL分析具有相似的结果（图3B-C）。此外在成熟过程中表达变化的基因与研究者STZ研究中Glut2high和Glut2lowβ细胞中变化基因的重叠有限（图3E-H）。韦恩图中重叠的部分包括Ucn3和Glut2等基因，与β细胞成熟以及β-1，2，3细胞转变过程相关。
图3. Glut2low细胞代表不同于未成熟β细胞的状态。（A-C）分别代表Ngn3-Cre;Rosa-RFP+β细胞的PCA图、UMAP图以及FDL图，每个点代表一个单细胞样本，不同阶段、细胞类型、处理条件以及Glut2表达水平的细胞用颜色标注，细胞数量标注在括号内。黑色和红色的曲线分别表示成熟以及STZ相关的轨迹；（D）P3、P12、P21以及P60胰腺组织中胰岛素和GLUT2的免疫荧光染色，箭头表示胰岛素+GLUT2lowβ细胞，标尺为20 mm；（E）韦恩图说明成熟相关基因与图2D中1-3群体差异表达基因之间的重合；（F-H）热图说明865个成熟相关基因（F）、134个成熟以及STZ相关基因（G）以及317个STZ相关基因的表达图谱，每一列代表一个单细胞样本，每一行代表一个基因，每个基因集簇中基因数量标注在热图的左侧。
4 非β内分泌型细胞的表达图谱在STZ模型中并不受影响
为了探究STZ模型中非β内分泌细胞是否受到影响，研究者对α细胞、δ细胞以及PP-细胞进行了拓展分析。尽管有一小部分细胞表达Ins1/Ins2， Gcg， Sst，或者Ppy中至少两种基因，这些多激素表达细胞基于它们的转录图谱被定义为特异的内分泌细胞类型（图1B-C）。研究者发现对照组和STZ处理组中α细胞、δ细胞以及PP-细胞在PCA和UMAP图中重叠，但是并未形成与STZ处理不同的集簇（图4A-B）。此外基于高度变异基因进行层次聚类并未在对照和STZ处理的小鼠间区分非β内分泌细胞，提示与β细胞不同，α细胞、δ细胞以及PP-细胞并不受STZ处理的影响（图4C）。此外，剪影分析提示在对照和STZ处理小鼠中，α细胞、δ细胞以及PP-细胞是同质的，而对照组中的β细胞是异质的，并且高剂量STZ处理后，β细胞存在三种亚群（图4D）。因此，研究者总结道STZ处理并不影响非β内分泌型细胞的转录图谱。
有报道称在正常的生理条件下，Glut2lowUcn3low“原始的”β细胞代表α细胞向β细胞转分化的中间状态。研究者因此对内分泌谱系进行PCA、UMAP、FDL进行分析。然而研究者并未在PCA、UMAP、FDL图中检测到一条清晰的STZ诱导的从α细胞向β细胞转分化的轨迹（图4E-G）。此外，研究者对群体1的β细胞(Glut2high)、群体2的β细胞(Glut2low)以及α细胞之间进行了层次聚类分析，但是并未发现群体2的β细胞在转录水平与α细胞更加相似。这些结果提示从α细胞向Glut2low的β细胞转分化过程可能不是维持STZ处理后β细胞群体的主要机制。
图4. STZ模型中非β内分泌细胞的转录图谱。（A-B）Ngn3-Cre; Rosa-RFP胰腺中α-、δ-以及PP-细胞的PCA和UMAP，每个点代表一个单细胞样本，颜色表示处理条件；（C）α-、δ-以及PP-细胞中高度可变基因的层次聚类，每一列代表一个单细胞样本，每一行代表一个基因；（D）对C中α-、δ-以及PP-细胞的层次聚类进行剪影分析。一个相对较高的平均剪影宽度表示一个明确的聚类结果。如果在N集簇上发现平均剪影宽度的峰值，细胞被聚类为N亚群，相反如果没有观察到明显的峰图，表示细胞是同源的；（E-G）Ngn3-Cre; Rosa-RFP胰腺中内分泌细胞的3D PCA（E）、UMAP（F）以及FDL（G），每个点代表一个单细胞样本，颜色表示细胞类型和处理条件，Ins1, Ins2, Gcg, Sst, Ppy, 以及 Glut2的表达水平在右侧表示。
结论
研究者在生理和病理条件下证实了β细胞的异质性。然而并未观察到β细胞由Glut2low向Glut2high的转变、非β内分泌细胞的转录改变或者从α细胞向β细胞系的直接转分化。研究者的结果证实了STZ处理胰岛细胞的状态，并且可以对糖尿病研究常用的STZ模型进行重新评估。
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