科研 | Adv. Sci. ：碳点剂量依赖性诱导的ROS通过激活mTOR信号和谷氨酰胺代谢促进葡萄膜黑色素瘤细胞的致瘤性
编译：微科盟张娜，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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葡萄膜黑色素瘤（UM）是成人中最常见的眼内恶性肿瘤，转移后生存率低；来源于对活性氧（ROS）敏感的黑素细胞。碳点（Cdot）纳米粒子具有独特的光物理特性、低细胞毒性和有效促进ROS产生，有望用于癌症检测和治疗。但是，Cdots对肿瘤代谢和生长的作用尚不十分清楚。本文中，研究人员在体外和体内，利用斑马鱼和裸鼠异种移植模型，研究了Cdots对UM细胞代谢组学、生长、侵袭性和致瘤性的影响，发现Cdots可剂量依赖性地增加UM细胞中ROS水平：在Cdots浓度低于100µg mL-1时，Cdot诱导的ROS可促进UM细胞的生长、侵袭性和致瘤性; 在200µg mL-1浓度时，UM细胞发生凋亡。添加抗氧化剂可逆转Cdots的致瘤作用；25–100µg mL-1的Cdots可激活Akt/哺乳动物雷帕霉素（mTOR）信号并增强谷氨酰胺代谢，产生级联反应，促进UM细胞生长。这些结果表明，适量的Cdots可以促进UM细胞的致瘤性。该研究为纳米粒子在肿瘤成像和治疗中的应用奠定了基础。
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实验设计
实验结果
1. Cdots的特征
研究人员根据高分辨率的透射电子显微镜（HRTEM）看见Cdots分散良好，平均直径约为3nm，并显示出显着的晶体结构（图1A，B）。Cdot 紫外可见吸收光谱在240和352nm处显示吸收峰，原因是由于共轭C=C结构的π-π*跃迁和n-π*C=O跃迁（图1C）。傅立叶变换红外（FTIR）光谱显示在3259 cm-1处的峰对应于O-H和N-H键的振动，在1637和1265cm-1处对应于平面弯曲C=C的C振动和C-O-C键，表明为官能团-COOH，-OH，和-NH2（图1D）。
2. Cdots促进UM细胞生长
Cdots的低细胞毒性对于在UM检测和治疗中的应用尤为重要。研究人员使用0、25、50、100和200µg mL-1的Cdots处理72小时，评估正常视网膜色素上皮（RPE）细胞，Pig1黑素细胞和两个UM细胞系Mum2B和92.1的生存能力。结果表明，0–200µg mL-1的Cdots对正常RPE或Pig1细胞的存活率没有显着影响；而200µg mL-1的Cdots处理48小时即可抑制UM细胞的生长。
研究者通常需要在24小时内从组织中去除纳米材料，为模拟去除Cdots后的长期（>24h）效应，研究人员分别使用0、25、50、100和200µg mL-1的Cdots处理正常和UM细胞24 h，去除Cdots后，继续培养细胞24小时，并计数活细胞数。结果表明，各种浓度的Cdots不会影响RPE和Pig1细胞的生长；在50-100µgmL-1 的Cdots可促进Mum2B细胞生长，50-100µg mL-1 的Cdots可促进92.1细胞生长（图 2A，B）。200µg mL-1浓度的Cdots可抑制两种UM细胞的生长。ROS作为信号分子或有毒物质取决于ROS的浓度和抗氧化剂的含量，与正常细胞相比，ROS对UM细胞的影响更为显著，因此，较高水平的ROS可以诱导氧化损伤和UM细胞死亡。
3. Cdots通过诱导ROS恢复UM细胞中的氧化还原平衡
氧化还原稳态对细胞生长至关重要，ROS在调节氧化还原状态中发挥重要作用。中等水平的ROS会激活与增殖有关的信号通路，并促进肿瘤细胞的生长。Cdots含有含氧基团，包括羧基和羟基，内吞的Cdots可诱导细胞内ROS累积，因此，研究人员用Cdots处理后检测了细胞中ROS的水平。0，25，50，100，和200µg mL-1 浓度的Cdots处理UM细胞24小时，通过DCFH-DA荧光染色和荧光定量酶标仪检测ROS水平。结果表明，Mum2B和92.1细胞均表现出Cdots剂量依赖性的ROS水平升高，而取出Cdots并继续培养24小时后，Cdots处理组的ROS水平均恢复到未处理水平，这些结果表明细胞内ROS水平与Cdots浓度直接相关。
谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的三肽的活性形式，可作为细胞内抗氧化剂，在增殖和分化过程中发挥保护作用，ROS可被还原型谷胱甘肽（GSH）清除。当细胞处于氧化应激时，GSH可提供最快的代谢反应；当ROS水平升高时，过氧化物酶催化GSH和H2O2反应将GSH转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GSH/GSH+ GSSG比率通常用作氧化还原平衡的指标。在两种UM细胞系中，与未处理的对照组相比，25–100µg mL-1浓度的Cdots处理24小时可增加GSH/GSH + GSSG比率。去除Cdots继续培养24小时后，GSH/GSH+ GSSG的比率仍然很高（图2D）。这些结果表明，将UM细胞暴露于中等浓度的Cdots会增加GSH/GSH + GSSG的比率，这与先前观察到的细胞内ROS增加相符。
GSH在促进癌细胞生长、化疗抗性和肿瘤发生中发挥重要作用。在乳腺癌细胞中，PI3K信号传导可增加GSH表达；在神经母细胞瘤和霍奇金淋巴瘤中，癌基因n-myc和c-myc可增强氨基酸转运并促进GSH合成。中等浓度（50µg mL-1）的Cdots可诱导UM细胞产生ROS，导致GSH合成增加，以清除ROS，恢复氧化还原平衡，促进持UM细胞生长；而较高浓度（200µg mL-1）的Cdots抑制了UM细胞的生长，并由于ROS水平过高而导致UM细胞凋亡。
4.Cdots通过诱导ROS促进UM细胞的生长、迁移和侵袭
为了进一步观察Cdots诱导的ROS对UM细胞表型的影响，研究人员设置不同组别观察UM细胞生长、迁移和侵袭：Cdots+ROS抑制组：Cdots（50µg mL-1）和ROS抑制剂（100µm NAC或10µmToc）；Cdots组：仅使用Cdots（50µg mL-1）；ROS抑制剂组：单独使用ROS抑制剂；对照组：未处理。在培养72小时后，Cdots组Mum2B细胞生长显着增加，而Cdots+ROS抑制剂组可抑制细胞生长，从而导致细胞增殖率与对照组或ROS抑制剂组的Mum2B细胞相似（图3A，B）。该结果表明，Cdots对UM细胞的增殖作用是通过诱导ROS介导的。
同样，50µg mL-1浓度的Cdots可显着促进Mum2B细胞迁移和侵袭，加入抗氧化剂（NAC或Toc）可阻断该作用（图 3C–F）。这些结果表明，Cdots促进UM细胞迁移和侵袭作用是由ROS介导的。浓度较高的Cdots（200µg mL-1）对UM细胞迁移无明显影响。
5. Cdots促进UM细胞致瘤性
接下来，研究人员使用体外集落形成测定、斑马鱼异种移植模型、裸鼠皮下异种移植模型和眼内异种移植模型研究了Cdots诱导的ROS对UM细胞肿瘤发生的影响。尽管50µg mL-1的Cdots显着促进Mum2B细胞集落形成，但NAC或Toc可消除这种作用（图4A，B）。该结果表明，Cdots对UM细胞的体外致瘤作用是由ROS介导的，较高浓度的Cdots（200 µg mL-1）可抑制UM细胞的致瘤性。
在斑马鱼异种移植模型中，研究人员用红色荧光染料CM-Dil标记Mum2B和92.1细胞，并注入到斑马鱼卵黄囊中。斑马鱼在含有Cdots的水中培养24小时，然后在无Cdots的水中培养7天，使用荧光显微镜测量肿瘤大小，与对照组相比，25、50和100µg mL-1浓度的Cdots可显著促进Mum2B和92.1细胞肿瘤生长（图 4C，D）。为了构建裸鼠皮下异种移植模型， 研究人员使用50µg mL-1的Cdots预处理Mum2B细胞，之后加入NAC 处理24小时；然后，将悬浮于100 µL Basement Matrigel中的Mum2B细胞皮下植入裸鼠的腹侧。结果表明，50µg mL-1的Cdots显着促进了肿瘤的生长，而50µg mL-1的Cdots和NAC共处理可消除这种作用，导致肿瘤的生长与未经处理的细胞或经抗氧化剂处理的细胞相似，而较高浓度的Cdots（200µg mL-1）可明显抑制UM细胞的致瘤性（图5A，B）。为了在另一种肿瘤模型中验证这些发现，研究人员以与皮下异种移植模型相同的方式预处理B16F10细胞，然后将其直接注射到裸鼠的左眼中以构建眼内异种移植模型，在此模型中观察到的肿瘤生长趋势与皮下异种移植模型中的趋势一致（图5C，D）。这些结果表明，Cdots在体内对UM细胞的致瘤作用是由其诱导的ROS介导的。
6. Cdots诱导的ROS促进氨基酸和脂肪酸代谢
之前的研究表明，碳纳米材料诱导ROS引起DNA变性并具有致癌作用，例如，碳纳米管在人支气管上皮细胞中引起DNA损伤和核颗粒形成；氧化石墨烯导致人间充质干细胞和新生儿成纤维细胞中的DNA断裂和染色体不稳定；碳纳米金刚石可增加小鼠胚胎细胞中DNA片段的表达（p53，OGG-1，Rad51和XRCC-4），表明增加了发生肿瘤的风险；石墨烯纳米点可增加DNA损伤相关基因p53，Rad51和OGG1的表达；呼吸道暴露碳纳米可刺激MAPK，NF-κB，和Akt信号传导，促进肺癌进展。由于代谢变化先于信号传导和DNA损伤，所以研究人员评估了Cdots处理的UM细胞代谢变化，以深入研究Cdots致瘤作用的潜在机制。
研究人员使用液相色谱-质谱仪（LC-MS）测定代谢物的变化。结果表明，与未处理的对照Mum2B细胞相比，Cdots组氨基酸合成和代谢能力增强，比如谷氨酸（Glu），谷氨酰胺（Gln），亮氨酸（Leu），酪氨酸（Tyr），吡醇（氨基酸转氨酶和脱羧酶辅酶）和生物素（氨基酸羧化酶和脱羧酶辅酶）和氨基酸代谢产物，比如乙醇酸，甜菜碱，肌酸和肌酐。在Cdots组中，饱和脂肪酸的含量较高，比如月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸和硬脂酸；不饱和脂肪酸花生四烯酸的水平较低（图6）。
7. Cdots诱导的ROS激活雷帕霉素（mTOR）信号并增强谷氨酰胺代谢
肿瘤细胞改变其新陈代谢，以满足快速增殖的需要，例如，肿瘤细胞高度依赖谷氨酰胺，谷氨酰胺为合成氨基酸、脂肪酸和核酸提供氮和碳，以补充三羧酸循环所需的中间产物，并满足谷氨酰胺的需求。正常细胞倾向于摄取外源脂肪酸，而肿瘤细胞从头合成脂肪酸，用于膜和信号分子的生物合成。肿瘤细胞通常还使糖酵解与丙酮酸氧化和三羧酸循环（沃伯格效应）分离，从而更快地产生能量。由于谷氨酰胺的重要性，研究人员研究了Cdots处理的UM细胞中与谷氨酰胺代谢相关的基因表达的变化。
研究人员使用谷氨酰胺检测试剂盒验证LC-MS的结果，他们使用不同浓度的Cdots培养Mum2B或92.1细胞24小时，细胞内谷氨酰胺水平没有明显变化（图7A）；然而，去除Cdots继续培养24小时后，50和100µg mL-1 Cdots处理Mum2B细胞可观察到在谷氨酰胺水平增加，Cdots并在暴露于25和50µg mL-1 Cdots处理92.1细胞可观察到在谷氨酰胺水平增加，而同时使用NAC或Toc可消除这种作用，导致谷氨酰胺的水平与对照组细胞相似（图 7B）。这些结果表明，UM细胞中，Cdots诱导的谷氨酰胺水平上调是由ROS介导的。
mTOR是肿瘤细胞中重要的细胞内传感器和代谢调节剂，mTOR形成两个多蛋白复合物，mTORC1和mTORC2。mTORC1受Akt信号通路的调节。Akt阻断结节性硬化复合物2（TSC2），并通过Rheb GAP的磷酸化激活mTORC1。在葡萄糖饥饿状态下，Akt与细胞中耗氧量和ROS的产生有关，暗示Akt/mTORC1信号通路有助于调节肿瘤细胞中的氧化平衡。mTORC1还可通过直接激活核糖体蛋白S6激酶（S6K）和抑制eIF4E结合蛋白（4EBP）来增加代谢酶和代谢相关转录因子的翻译，从而调节代谢。在氨基酸代谢中，mTORC1信号传导可增加谷氨酰胺和谷氨酸脱氢酶的表达，加速谷氨酰胺分解为谷氨酸和α-酮戊二酸，增加鸟氨酸脱羧酶和精氨酸琥珀酸合成酶的表达，促进精氨酸的代谢；增加SLC7A5和SLC43A1的表达，并增强支链氨基酸的摄取。在脂肪酸代谢中，mTORC1信号传导可增加脂肪酸合成酶和硬脂酰CoA脱氢酶1（SCD1）的表达，并加速脂肪酸的合成。
研究人员使用Western blotting，研究UM细胞中Akt/mTOR信号通路是否参与了由Cdots诱导的ROS引起的代谢变化。磷酸化的Akt，mTOR，S6K和4EBP的表达随Cdots浓度的增加而增加（图7C），表明Cdots诱导的ROS激活了Akt/mTOR信号通路。
随后，研究人员使用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析了UM Mum2B和92.1细胞中Cdots对谷氨酰胺代谢相关基因（SLC7A11、SCL3A2、PYCR1、PYCR2、PSAT1、GPT2、GOT1、GOT2、GLUD1、GFPT1、GFPT2和ALDH18A1）表达的影响。结果表明，不同浓度的Cdots处理24小时不影响谷氨酰胺代谢相关基因的mRNA水平（图7D）；但是，在去除Cdots后继续培养24小时，这些基因的mRNA表达水平明显增加。这些结果表明，Cdots诱导的ROS上调了葡萄膜黑色素瘤细胞中谷氨酰胺代谢相关基因的表达；谷氨酰胺代谢增加可加速谷氨酰胺向谷氨酸的转化以及谷氨酸向α-酮戊二酸转化，进入三羧酸循环并生成三磷酸腺苷（ATP），促进肿瘤细胞的生长。
基于这些结果，研究人员提出可通过Cdots刺激UM细胞发育，细胞内吞Cdots后，细胞内ROS升高。适度的ROS激活Akt/mTOR信号传导的刺激信，导致谷氨酰胺相关基因表达上调并加速谷氨酰胺代谢，从而促进UM细胞生长。高浓度的Cdots会刺激产生过多的ROS，从而导致UM细胞死亡（图8）。
图8 Cdots对肿瘤细胞中谷氨酰胺代谢的影响模式图
结论
该研究表明适量的Cdots可促进UM细胞的肿瘤发生，这种促癌作用主要是由Cdots诱导ROS产生从而激活Akt/mTOR信号传导并增加了谷氨酰胺代谢，从而促进了UM细胞的增殖和转移。因此，癌症检测和治疗应用中应严格注意Cdots的浓度。