科研 | J. Hazard. Mater：纳米TiO2诱导小麦糖损伤和代谢途径向氨基酸代谢转变
编译：张振炎，编辑：Emma、江舜尧。
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TiO2作为广泛使用的一种纳米材料，能够在各个环境介质(包括空气、土壤、水体)中积累。土壤中残留的纳米TiO2有可能损害植物生长发育，但是植物生理响应背后的具体代谢机制仍未能被完全理解。在本研究中，小麦分别用不同浓度(0, 5, 50, 150 mg/L)的纳米TiO2处理21天，随后测定、分析叶部与根部的代谢产物组成。经纳米TiO2处理后，超过70%的代谢物含量发生了变化，并且随着纳米TiO2浓度的提升代谢物受到的影响增大，其中叶部代谢物变化相比于根部更为显著。在根部，单糖、壬二酸、γ-氨基丁酸含量增加，同时酪氨酸代谢途径上调；而在叶部，糖与生育酚代谢以及苯丙氨酸和色氨酸途径上调。纳米TiO2处理同时促进根部与叶片中天冬氨酸代谢途径，连同丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸代谢以及甘油脂生物合成，而高浓度纳米TiO2处理后柠檬酸和乙醛酸代谢在两个部位小麦样品中均有下调。由于纳米TiO2对光合作用的干扰，糖的生物合成被破坏，细胞代谢发生转变——以氨基酸作为替代性的能量代谢底物，而活性氧与糖都作为信号分子激活抗氧化反应。总结来说，纳米材料污染能严重影响农作物多个代谢途径，最终影响植物生长发育。
论文ID
实验设计
实验所用纳米TiO2(Aeroxide® P25)购买于Sigma Aldrich，由锐钛矿与金红石80:20的比例组成，纯度≥99.5 %，粒径21 nm，比表面积为35-65 m2/g。超纯水配制的1 g/L纳米TiO2母液超声后用1/4霍格兰营养液稀释到实验浓度(0, 5, 50, 150 mg/L)。小麦消毒后置于培养皿中萌发，用湿润的纸作为萌发的基质，每个培养皿中加入10mL不同浓度的纳米TiO2溶液，3天后移苗至含同浓度纳米TiO2溶液的容器中进一步生长。植物在严格控制的实验室条件下继续生长17天，培养液连续曝气并且每3天更换一次。从种子到植株培养21天后取根和叶片的样品，样品在液氮中快速冷冻后储存在-80℃冰箱中保存用于代谢组分析。
实验结果
1. 代谢物含量变化
纳米TiO2处理改变了小麦根与叶片中代谢物含量。总代谢物含量仅在根部有显著差异，150 mg/L纳米TiO2处理后小麦根部中代谢物含量超过了对照组的4倍。而在叶部，总代谢物含量虽然没有显著受到纳米TiO2处理影响，但是仍然有随浓度上升的趋势(图1)。
图1 所有鉴定出的代谢物的总含量
不同字母表示不同浓度纳米TiO2处理具有显著差异(根与叶分开计算显著性，p≤0.05)。
根部与叶部单糖的含量最多，其次是二糖(图2)。在根部，浓度大于50 mg/L的纳米TiO2处理对代谢物有显著影响，其中，50 mg/L时氨基酸类含量增加，而在150 mg/L时单糖的含量显著增加，羧酸、二糖和醇类物质的含量显著减少。在叶部，氨基酸的含量在所有浓度纳米TiO2处理后都显著增加，而单糖含量在最高浓度组中显著下降(图2)。
图2 不同浓度纳米TiO2处理后叶和根中各类化合物的含量：羧酸、氨基酸、单糖、双糖和醇
不同字母表示不同浓度纳米TiO2处理具有显著差异(根与叶分开计算显著性，p≤0.05)。
2. 评估膳食和药物
分别在叶部和根部共鉴定出85种和47种代谢物。在叶部，有27种代谢物含量在纳米TiO2处理后发生了显著变化，其中显著增加的有：L-苏糖酸、核糖酸、柠檬酸、甘油酸、L-丙氨酸等，显著下降的包括乳酸、壬二酸、苯丙氨酸、D-(+)-半乳糖、甘露糖等(表1, 2)。此外，20种代谢物仅在处理组叶部检测到，3种仅在对照组叶部检测到。
而在根部，共有47种代谢物含量在纳米TiO2处理后含量发生了显著变化，但是没有代谢物含量显著下降，含量显著增加的化合物主要有：L-天冬氨酸、L-氧化脯氨酸、L-苏糖酸、D-阿洛糖、甲基-D-半乳糖等(表3)。此外，18种代谢物仅在处理组根部检测到，1种仅在对照组根部检测到。
表1 不同浓度纳米TiO2处理对小麦叶部代谢物含量的影响(极性相中鉴定的代谢物)
变化倍数等于Log2(处理组含量/对照组含量)。数值用平均值±标准差表示。nd表示未检测到。不同字母表示不同浓度纳米TiO2处理具有显著差异(p≤0.05)。
表2 不同浓度纳米TiO2处理后小麦叶部代谢物的相对峰面积(代谢物峰面积/内标峰面积)和非极性相鉴定出的代谢物变化倍数(Log2(处理组含量/对照组含量))
数值用平均值±标准差表示。不同字母表示不同浓度纳米TiO2处理具有显著差异(p≤0.05)。
表3 不同浓度纳米TiO2处理对小麦根部代谢物含量的影响及变化倍数(极性相中鉴定的代谢物)
变化倍数等于Log2(处理组含量/对照组含量)。数值用平均值±标准差表示。nd表示未检测到。不同字母表示不同浓度纳米TiO2处理具有显著差异(p≤0.05)。
2. 主成分分析
主成分分析(PCA)可以清楚地反映在根与叶中代谢物组成不同，同时不同浓度之间也有显著差异(图3A)。纳米TiO2处理下叶部代谢物变化主要与氨基酸相关，而根部代谢物变化主要与单糖相关(图3B)。
图3 极性相中鉴定的代谢物主成分分析
3. 通路富集分析
通路富集分析显示，随着纳米TiO2浓度的增加，代谢途径变化显著，并且在根部与叶部现象一致(图4)。
在叶部(图4A-C)，共鉴定到17条代谢通路受到纳米TiO2处理影响。其中，苯丙氨酸生物合成、甘油脂代谢、氨基酰基- tRNA生物合成以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成仅受50和150 mg/L纳米TiO2处理影响。随着纳米TiO2浓度的上升，10条代谢通路显著上调，2条下调。
在根部(图4D-F)，共鉴定到13条代谢通路受到纳米TiO2处理影响，其中10条随随纳米TiO2浓度增加显著上调，包括了异喹啉生物碱合成、酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、氨基酰基- tRNA生物合成以及半乳糖代谢。随着浓度提升，根部受影响的代谢通路增加(5、50、150 mg/L纳米TiO2处理分别干扰了5、7、12条代谢通路)。异喹啉生物碱生物合成、酪氨酸代谢、肌醇磷酸盐代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成以及谷胱甘肽代谢仅在高浓度的根部受到干扰。
图4 通路富集分析显示了5 mg/L (A, D)、50 mg/L (B, E)和150 mg/L (C; F)纳米TiO2处理对小麦叶部(A-C)以及根部(D-F)代谢通路的干扰
途径富集分析确定了哪些代谢途径受到了纳米TiO2显著的干扰。点的大小表示受干扰程度(影响值)，而颜色从黄到红表示受干扰的显著性。
讨论
在本研究中，从代谢组学数据可以看出，纳米TiO2处理后小麦根部以及叶部活跃的代谢途径发生了变化，根部与叶部代谢途径的受干扰程度不同并且两者的差异随浓度增大而增大。在150 mg/L纳米TiO2处理后，小麦根部代谢物变化主要与单糖有关，而在相同浓度下，叶片氨基酸变化显著。说明高浓度纳米TiO2处理引起小麦根部单糖含量的增加(6/9的单糖含量与纳米TiO2浓度呈强正相关)以及叶部氨基酸含量的增加(5/15的氨基酸含量与纳米TiO2浓度呈强正相关)。代谢组数据表明，小麦根部能够很自然地适应5、50 mg/L纳米TiO2处理后引起的毒性效应，而叶部更为敏感。同时小麦这两个器官对高浓度纳米TiO2处理的代谢响应均表现出高敏感性。
多元分析与通路富集分析能够清楚地反映，随着纳米TiO2浓度的增加，叶和根代谢物浓度变化以及通路受到的影响也会增加，并且通路影响值在叶部更高，说明纳米TiO2对小麦叶片的损害更大。
将根部与叶部通路分析结果整合后可以发现，受干扰最大的代谢通路主要包括莽草酸途径(酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸代谢)，氨基酸代谢(丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成)，碳水化合物代谢(半乳糖、淀粉和蔗糖代谢)以及脂代谢(甘油脂代谢和乙醛酸和二羧酸代谢)。
1. 莽草酸途径
在根部，影响值较高的代谢通路与酪氨酸有关：异喹啉生物碱的生物合成和酪氨酸代谢。酪氨酸是植物中具有重要作用的几种代谢物的前体，在50和150 mg/L纳米TiO2处理组中均有上调，并且其含量与纳米TiO2浓度正相关(R2=0.8，p=0.009)。以酪氨酸为前体的次生代谢物包括生育酚、质体醌、甜菜素、3,4-二羟基苯丙氨酸、异喹啉生物碱和木质素，它们在植物中具有不同的作用，如抗氧化、防御、电子传递和结构支撑等。因此，纳米TiO2触发了莽草酸途径，提高根中的酪氨酸含量，从而促进次生代谢物的生物合成。
除根部外，叶部(50和150 mg/L纳米TiO2处理)芳香族氨基酸和草酸盐途径的下游产物也上调：苯丙氨酸和色氨酸。苯丙氨酸能够产生几种抗氧化代谢产物(如黄酮醇、香豆素和木质素)，可转化为酪氨酸，同时又是水杨酸的前体；而色氨酸代谢产生植物激素吲哚-3-乙酸(IAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)，也是许多防御功能化合物和蛋白质合成的前体。与根相反，叶部丙二醛含量、总抗氧化活性和膜透性增加，同时H2O2含量呈上升趋势。因此，叶部触发部分代谢途径以重建细胞内氧化稳态，如苯丙氨酸代谢。除苯丙氨酸上调外，还检测到香豆素糖苷的增加(150 mg/L处理组)。多酚类香豆素具有光保护和抑制活性氧的作用，并且糖基化能够促进转运，香豆糖苷含量的增加似乎是对活性氧含量上升的反应，并能减轻纳米二氧化钛处理造成的光损伤和氧化损伤。色氨酸能够产生植物生长的关键激素IAA，受环境信号以及可溶性糖含量变化的调控。因此，碳水化合物的改变可能刺激了色氨酸代谢产生IAA，而IAA从叶片转运到根有助于减轻根损伤。
与莽草酸途径有关的还有奎尼酸，它是莽草酸途径的一个分支以及绿原酸前提物质，其含量在纳米TiO2处理后的根部与叶部都下降了。植物通常会倾向于莽草酸或奎尼酸其中一种物质的积累，而不是全部，而小麦似乎更倾向于莽草酸的积累以产生芳香族氨基酸。
莽草酸途径代谢了30-50%的碳固定产物，尤其是在受胁迫的植物中，小麦单糖含量的上调可能是对莽草酸盐途径中糖需求增加的响应。
2. 氨基酸代谢
除了芳香氨基酸外，纳米TiO2处理还触发了根和叶中的其他氨基酸代谢过程:甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成。叶部相比于根部氨基酸含量的变化更多，叶部异亮氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和二甲基甘氨酸含量均与纳米TiO2浓度正相关，而根中只有脯氨酸呈正相关，叶部氨基酸含量也明显高于根部。尽管如此，氨基酸含量在不同组的根部中也有明显差异，7种氨基酸只在处理组的根部检出。氨基酸在抗非生物胁迫中发挥着重要作用，包括：作为氮、碳和能量储存库，作为渗透调节剂、金属螯合剂，有助于酶和/或膜稳定。因此，氨基酸在小麦叶部的高积累是对纳米TiO2毒性的适应性反应，反映了叶部代谢的失衡。
小麦叶部与根部，天冬氨酸途径受到影响，引起四种必需氨基酸(赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸)以及甘氨酸合成的改变。这些氨基酸的主要与蛋白质合成有关，但同时也通过三羧酸循环参与细胞能量代谢。纳米TiO2处理后小麦根部与叶部蛋白质总量并没有上升，说明氨基酸含量的增加与蛋白质合成无关。在无胁迫和光照条件下，光合作用是植物的主要能量来源，而在黑暗条件下，氨基酸和淀粉等代谢物作为能量代谢的底物（通过糖酵解、氨基酸代谢和三羧酸循环）。已有报道说明纳米TiO2能够破环植物光合作用，损害碳水化合物的合成和利用率，导致本研究中淀粉代谢增强以产生葡萄糖和其他单糖。同时，单糖能作为信号分子改变细胞代谢方式，以氨基酸等作为替代性的呼吸作用底物来通过三羧酸循环产生能量。因此，纳米TiO2处理后氨基酸合成的上调也是对能量代谢不足的一种响应。
除了天冬氨酸代谢，谷氨酸，丙氨酸和脯氨酸代谢也受到了纳米TiO2处理的影响。叶部和根部谷氨酸和丙氨酸均上调，而脯氨酸仅在50 mg/L处理组根中上调。谷氨酸是γ-氨基丁酸的主要前体，γ-氨基丁酸仅在暴露于150mg/L处理组的根部检出，其分解产物也能参与三羧酸循环，同时刺激半乳糖和淀粉代谢，增加可溶性糖含量。脯氨酸对胁迫响应和活性氧增加反应灵敏，有助于稳定亚细胞结构、清除活性氧、调节氧化还原平衡。脯氨酸含量仅在50 mg/L处理组根中上升，而在150 mg/L组中下降，表明低浓度纳米TiO2处理刺激了脯氨酸产生以应对胁迫，而高浓度处理后脯氨酸含量的下降可能与脯氨酸渗出有关。游离脯氨酸含量在高浓度组根部中的下降也可能是用于在细胞壁上形成富含脯氨酸的蛋白质结合以保持细胞壁结构的完整性。
根和叶中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢均有上调，这些氨基酸与半胱氨酸合成相关。半胱氨酸是硫酸盐同化的主要产物，反过来也能直接参与其他非蛋白质硫醇的生物合成（如蛋氨酸、谷胱甘肽和植物螯合剂)和蛋白质硫醇(硫氧还蛋白、谷胱甘肽）。纳米TiO2对叶部谷胱甘肽含量的影响不显著，但根部谷胱甘肽含量的有所下降。而蛋白质硫醇的含量在纳米TiO2处理处理后的根部与叶部都有所上升。谷胱甘肽与蛋白质硫醇能产生螯合物螯合转运到叶片的钛元素或者产生能与蛋白结合的谷胱甘肽以保护蛋白质免受氧化胁迫。
3. 碳水化合物代谢
纳米TiO2处理导致了根部与叶部多种碳水化合物代谢的变化，并且根的变化更为明显。在150mg/L处理组的根部，二糖代谢生成单糖的过程较为明显：消耗蔗糖、甘露糖和乳糖以生成葡萄糖和果糖。而在叶部，葡萄糖含量的上升是淀粉、纤维素和二糖分解代谢的结果。与根相反，叶片中果糖和醛糖减少，木糖减少，蔗糖增加。糖作为营养物质和信号分子，能调节生长和应激反应，纳米TiO2处理导致更多的单糖需要被消耗以确保植物正常代谢。
4. 脂质代谢
在叶(50和150 mg/L)和根(150 mg/L)中，甘油脂代谢上调，且在叶片中更为显著。脂类，包括磷脂和游离脂肪酸，是生物膜的关键组成部分，并能作为信号分子。在叶片中观察到的不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸的减少反映了小麦对纳米TiO2的敏感性，而根部细胞膜脂质结构的改变同时又增加了对纳米TiO2的耐受性。叶片中脂肪酸的减少，特别是α-亚麻酸的减少，可能是由于生物合成的下调和/或ß-氧化。生育酚是一种抗氧化剂，通过中和脂质过氧化自由基和终止自催化脂质过氧化过程，保护多不饱和脂肪酸免受脂质过氧化损伤，其含量的上升证明了脂质氧化的进行。另一方面，关键的植物激素和信号分子——茉莉酸是α-亚麻酸的氧化产物，α-亚麻酸含量的下降也可能是分解为茉莉酸以调节植物应激响应。此外，不饱和脂肪酸（油酸、亚麻酸和亚油酸）的一种衍生物——壬二酸在150 mg/L处理组的根部积累，但在叶部中减少。壬二酸可以诱导水杨酸和甘油-3-磷酸促进根系对纳米TiO2的耐受性，而壬二酸在叶部含量的降低也解释了叶片对纳米TiO2胁迫更为敏感。
结论
全球土壤和水体中新兴污染物如纳米材料的污染及其对作物生长的影响仍是一个有争议的问题。纳米材料的植物毒性已经被广泛证明，主要是通过活性氧的积累和细胞内氧化还原状态的失衡导致氧化损伤。本研究证明，纳米TiO2处理后小麦代谢和生理变化影响显著，在叶部，主要与受到的氧化损伤有关，激活了以苯丙氨酸和色氨酸途径、氨基酸和甘油脂生物合成、谷胱甘肽-抗坏血酸循环和生育酚含量上调为目标的抗氧化防御系统（图5）。然而，对于高浓度处理，这些保护机制并不能阻止叶部细胞中生物分子受到氧化损伤以及光合作用受损导致的糖生物合成下调。另一方面，根部代谢变化对纳米TiO2处理的响应不同，触发了莽草酸途径中的酪氨酸代谢，上调单糖、脯氨酸、壬二酸和γ-氨基丁酸含量。然而，在两个器官，由于糖生物合成的破坏三羧酸循环均下调（图5）。糖含量的变化改变了细胞代谢过程，使其使用替代性的能量代谢底物，如氨基酸，而活性氧的积累和糖的限制都作为抗氧化反应的信号。此外，还可以推测植物激素含量也发生变化以调节植物对纳米TiO2的胁迫做出响应：比如叶部的IAA和茉莉酸含量的变化以及根部壬二酸和水杨酸含量的变化。
图5 纳米TiO2处理后表现小麦根部与叶部代谢变化的代谢网络图
变化倍数(Log2(处理组/对照组))显示为热图和矩形。仅在对照或仅在处理组的根/叶中检出的代谢物含量以灰色阶和圆形表示。白色矩形或圆形表示化合物未被检测到。DHAP:二羟丙酮磷酸;GABA: γ-氨基丁酸; MEP:甲基赤藓糖醇-4-磷酸。